用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对、检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还公开了实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明专利技术提供的引物对、试剂盒及检测方法在检测绒螯蟹肝孢虫上具有以下优点：与其他病原微孢子虫无交叉反应，特异性强；组内和组间重复性试验结果的变异系数均小于2%，重复性好；扩增效率为98.3%，最低可检测 2.87×101拷贝/μL，是普通PCR的100倍，本发明专利技术建立的方法扩增效率和检测的灵敏度更高；从绒螯蟹肝孢虫待检品提取DNA到结果分析整个实验过程只需要2h，检测效率大大提高。

Real time fluorescent quantitative PCR primer pair, detection kit and its application for detection of hepatopanbe of Eriocheir sinensis

The present invention discloses a real-time fluorescent quantitative PCR primer pair for detection of Eriocheir sinensis, the primer pair sequence is shown as SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2. The invention also discloses a real-time fluorescence quantitative PCR detection kit and its application. The primer pair, reagent kit and detection method provided by the invention have the following advantages: no cross-reaction with other pathogenic microsporidia, strong specificity; the coefficient of variation of intra-group and inter-group repeatability test results are less than 2%, good repeatability; amplification efficiency is 98.3%, and the minimum detectable copy is 2.87 *101. The method established by the present invention has higher amplification efficiency and detection sensitivity, and it only takes 2 hours to extract DNA from the sample to analyze the results, thus greatly improving the detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对、检测试剂盒及应用
本专利技术涉及微生物分子检测领域，具体涉及一种检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光PCR引物对、检测试剂盒及应用。
技术介绍
中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，又称河蟹、大闸蟹,因其味道鲜美和营养丰富，深受广大消费者的喜爱，是我国主要养殖的经济蟹类。然而，随着集约化养殖的发展，河蟹各类疾病频发，其中“水瘪子”是近几年对河蟹造成危害最严重的病害之一，其引起的症状主要表现为病蟹的肝胰腺颜色发生变化，从健康时的黄色肝胰腺变浅到进一步发展至乳白和灰黑色，胸腔积液，肝胰腺和肌肉大量萎缩甚至消失等症状，给河蟹养殖业带来了巨大的经济损失。但是迄今导致河蟹“水瘪子”的原因众说纷纭，病毒、微孢子虫、细菌等生物因素及杀虫药物的滥用、养殖水质、种质退化和营养等非生物因子都被认为是可能的原因。绒螯蟹肝胞虫(Hepatosporaeriocheir)是一种寄生于中华绒螯蟹肝胰腺的微孢子虫。绒螯蟹肝胞虫的感染可能与“水瘪子”的发生相关。“水瘪子”是近几年对河蟹造成危害最严重的病害之一，给河蟹养殖业带来了巨大的经济损失。但是迄今导致河蟹“水瘪子”的原因众说纷纭，病毒、微孢子虫、细菌等生物因素及杀虫药物的滥用、养殖水质、种质退化和营养等非生物因子都被认为是可能的原因。之前有研究表明，绒螯蟹肝胞虫的感染可能与“水瘪子”的发生相关。目前关于绒螯蟹肝胞虫的检测方法，主要有镜检法、常规PCR法、实时荧光定量PCR法以及原位杂交法。虽然这些方法都能达到检测绒螯蟹肝胞虫的目的，但是仍有一些不足，比如，漏诊率高，易出现假阳性，敏感性相对较低，操作繁琐，耗时长等，例如丁正峰建立的绒螯蟹肝胞虫实时荧光定量PCR检测方法，扩增效率只有79.1％，灵敏度检测下限只能达到200拷贝/μL，不适用于低浓度样本的绒螯蟹肝胞虫检测。因此，现在需要建立一种高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的方法，该方法不仅可以为绒螯蟹肝孢虫的高灵敏度、快速准确检测提供有效技术手段，而且还可以为“水瘪子”病病因的初步筛查和“水瘪子”病的有效防控提供重要的技术支持和参考资料。
技术实现思路
专利技术目的：为建立一种高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的方法，本专利技术通过在分析和比对绒螯蟹肝胞虫18SrDNA基因序列的基础上，设计特异性引物扩增并克隆相应片段，构建由绒螯蟹肝胞虫基因片段和pMD-18载体连接而成的质粒标准品，建立了绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR方法，该方法为绒螯蟹肝孢虫的高灵敏度、快速检测提供了一种有效的技术手段。因此，本专利技术所要解决的技术问题是提供了用于高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒。本专利技术还要解决的技术问题是提供了实时荧光定量PCR检测试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种绒螯蟹肝胞虫的检测方法。技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的引物对，所述引物对由HE-F和HE-R组成，所述引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。HE-F：5'CTCTATCGGAAGATGGGGAA3'；HE-R：5'GCTCTGGCTTGGTAAGTTTT3'。本
技术实现思路
还包括一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒，含有所述的引物对的试剂盒。其中，所述的试剂盒包括：(1)Real-timePCRMix及所述的引物对的混合液；(2)阳性标准品；(3)阴性对照物。其中，所述阳性标准品是含有绒螯蟹肝胞虫基因片段的重组质粒。该基因片段的序列如SEQIDNO:3所示。其中，所述阳性标准品的制备过程如下：(1)提取绒螯蟹肝胞虫DNA：采用QIAGENDNeasyBlood&Tissue试剂盒按照说明书步骤提取绒螯蟹肝胞虫DNA于－20℃保存。(2)常规PCR扩增：以绒螯蟹基因组DNA为PCR模板，以引物HE-F和HE-R为PCR引物，进行常规PCR扩增。扩增的反应体系是：10×PCRBufferMIX12.5μL，HE-F0.8μL，HE-R0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序是：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。(3)扩增结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的基因，将目的基因与PMD-18T载体进行连接、转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞。将转化成功的菌落纯化培养和PCR鉴定，PCR鉴定的反应条件如上述步骤(2)中所述，将PCR鉴定成功的菌液送往生物公司进行测序，序列比对正确后，采用OMEGA质粒小提试剂盒对阳性重组质粒进行提取，于-20℃保存备用。(4)将提取的阳性重组质粒在NanoDrop2000上测得260nm/280nm比值(满足在1.8-2.0)和浓度后并换算为拷贝数，10倍倍比稀释，取连续5个或5个以上不同梯度拷贝数的重组质粒在优化的反应条件下进行荧光定量PCR扩增，在5个或5个以上不同梯度拷贝数重组质粒满足扩增效率在90％-105％之间，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％的条件情况下，将这5个或5个以上不同梯度拷贝数的重组质粒作为阳性标准品。本
技术实现思路
还包括所述的一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。本
技术实现思路
还包括一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，所述检测方法是实时定量荧光PCR方法。其中，所述检测方法包括以下步骤：(1)提取绒螯蟹肝胞虫DNA：采用QIAGENDNeasyBlood&Tissue试剂盒按照说明书步骤从待测样品中提取绒螯蟹肝胞虫DNA，于－20℃保存。(2)将绒螯蟹肝胞虫DNA和阳性标准品作为模板，在包含HE-F、HE-R引物和荧光染料Real-timePCRMix的优化反应条件中同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个DNA浓度重复3次，以双蒸水作阴性对照。(3)PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪会根据阳性标准品扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值。重复多次得到多个CT值，然后取平均值得到△Ct值，以阳性标准品拷贝数的对数值为横坐标，△Ct值为纵坐标建立标准曲线，根据待检品的△Ct值在标准曲线上的位置确定待绒螯蟹肝胞虫的DNA初始浓度。(4)其中，检测结果的判定标准为：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含绒螯蟹肝胞虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有绒螯蟹肝胞虫。本
技术实现思路
还包括对采用的荧光定量PCR反应体系和反应程序的建立与优化，具体包括如下内容：1)建立20μL反应体系：Real-timePCRMix10.0μL；正向引物HH-F(10μM)0.8μL；反向引物HH-R(10μM)0.8μL；阳性重组质粒DNA模板1.0μL；ddH2O7.4μL。反应程序：95℃预变性3min；9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述引物对由HE‑F和HE‑R组成，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述引物对由HE-F和HE-R组成，所述引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。2.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对。3.根据权利要求2所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Real-timePCRMix、阳性标准品和阴性对照物。4.根据权利要求3所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品是含有绒螯蟹肝胞虫基因片段的重组质粒，所述阴性对照物是双蒸水。5.根据权利要求4所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该基因片段长度为162bp，该基因片段的序列如SEQIDNO:3所示。6.根据权利要求4所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的制备方法为：（1）以绒螯蟹肝胞虫基因组DNA为PCR模板，以引物HE-F和HE-R为PCR引物，将PCR扩增后得到的DNA片段与PMD-18T载体进行连接得到重组质粒；（2）将连接成功的阳性重组质粒测定浓度，10倍倍比稀释，取连续5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒在优化的反应条件下进行荧光定量PCR扩增，在5个或5个以上不同梯度浓度重组质粒满足扩增效率在90%-105%之间，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%的条件情况下，将这5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒作为阳性标准品。7.权利要求2~5任一项所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。8.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：章晋勇，罗丹，刘新华，赵媛莉，吴伟，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42