由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了由基因工程化的人造抗原提呈细胞aAPC的分泌小体囊泡，exosome所构建的T细胞疫苗的制备及应用。本发明专利技术通过转染两种真核表达质粒载体pcDNAHLA‑A2、pcDNACD80和感染两种重组腺病毒载体AdVGag、AdV41BBL，构造了一种基因工程化的K562A2/Gag/CD80/41BBLaAPC。然后通过差速超高速离心法从K562A2/Gag/CD80/41BBL培养上清液中纯化exosomes，并进行电子显微镜和免疫印迹分析。这些exosomes通过孵育和Con‑A刺激的HLA‑A2转基因小鼠的非特异性T细胞共孵育而构建了具有HLA‑A2限制性的和Gag特异性的Gag‑Texo疫苗。本发明专利技术用无限来源的不断生长的人工抗原提呈细胞aAPCK562A2/Gag/CD80/41BBL囊泡替换有限来源的DC囊泡用于制备HIV‑1Gag特异性T细胞疫苗。这种新颖的使用基因工程化抗原提呈细胞的囊泡制备T细胞疫苗的方法将对HIV‑1患者临床治疗性疫苗的研制具有重要的影响。

T cell vaccine constructed from secretory bodies of genetically engineered artificial antigen presenting cells and its preparation and Application

The invention discloses the preparation and application of T cell vaccine constructed by exosome and secretory vesicles of genetically engineered artificial antigen presenting cell aAPC. The invention constructs a genetically engineered K562A2/Gag/CD80/41BBLaAPC by transfecting two eukaryotic expression plasmid vectors pcDNAHLA_A2, pcDNACD80 and two recombinant adenovirus vectors AdVGag and AdV41BBL. Then exosomes were purified from K562A2/Gag/CD80/41BBL supernatant by differential ultracentrifugation and analyzed by electron microscopy and Western blot. These exosomes were co-incubated with non-specific T cells of HLA_A2 transgenic mice stimulated by C_A to construct Gag_Texo vaccines with HLA_A2 restriction and Gag specificity. The invention replaces the limited origin of DC vesicles with the continuously growing artificial antigen presenting cell aAPCK562A2/Gag/CD80/41BBL vesicles for the preparation of HIV_1 Gag specific T cell vaccine. This novel method of preparing T cell vaccines using genetically engineered antigen presenting cell vesicles will have an important impact on the development of clinical therapeutic vaccines for HIV_1 patients.

【技术实现步骤摘要】
由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法及应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-I)感染病人的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，是一种迅速扩大的全球大流行性疾病。有效的抗病毒疗法(HAART)能成功抑制病毒的复制，显著改善病人的预后[1]。然而，它不能恢复抗HIV-1免疫反应。在炎症慢性期的药物治疗并不能逆转由病毒引起的CD4+T细胞和CD8+效应T细胞的衰退，从而导致HIV-1病毒的潜伏[2]。因此，迫切发展在药物间断治疗过程中提高对病毒控制的新治疗策略具有现实意义，从而使病人可避免对药物的长期使用，进而减少其毒性和治疗成本。树突状细胞(DC)是体内最有效的抗原提呈细胞(APC)。他们已被用作疫苗在动物模型[3]和艾滋病患者临床试验[4,5]中刺激HIV特异性CTL反应。在这些试验中发现，安全状况良好，仅有轻微的局部副作用。然而，可能是由于缺陷的免疫系统如CD4+T细胞的帮助不足，由DC疫苗引起的HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应通常仅能低效率控制艾滋病患者的进展，因而需要探索一种更有效的HIV特异性治疗性细胞疫苗。我们以前通过Con-A刺激的非特异性T细胞摄取重组Gag表达腺病毒(AdVGag)感染的DC(DCGag)所释放的分泌小体(囊泡)EXOGag，开发了HIV-1Gag蛋白特异性树突状细胞(DC)分泌小体亦称囊泡(exosomes；EXO)靶向的T细胞(Gag-Texo)疫苗，并表明Gag-Texo相较DC疫苗能够不依赖宿主CD4+T细胞的帮助而刺激CTL反应并能逆转CD4+25+FoxP3+调节性T细胞的免疫抑制，从而能更有效的刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和治疗性免疫反应[6]。为了提高其免疫原性，我们进一步构造了4-1BBL表达的Gag-Texo疫苗，并证明了它具更有效的诱导HLA-A2转基因小鼠的CTL反应和治疗性抗肿瘤免疫[7]。我们最近的研究表明，Gag-Texo疫苗能通过CD40L-mTORC1途径抵抗慢性炎症介导的T细胞无能和逆转CTL耗竭[8]，提示我们的Gag-Texo新疫苗可能成为治疗性HIV-1疫苗。然而，获得大量自体树突状细胞的技术难点显著限制了DCs或DC释放的囊泡在临床免疫治疗中的应用[9,10]。当然亦将限制DC释放的囊泡所构造的囊泡靶向的T细胞疫苗在临床免疫治疗的应用。作为一种替代策略，以人肿瘤细胞为基础的人工抗原提呈细胞(aAPC)系统目前已经发展并且广泛用于作扩增用于免疫治疗的肿瘤特异性CTLs，其中缺乏内源性表达HLA-A、B和DR分子的人红白血病K562细胞株是最常用的aAPC[11]。因其CD54和LFA-3的表达有助于形成一个有效的免疫突触促进T细胞活化[11,12]，而其缺乏内源性表达HLA-A，B和DR分子从而限制其同种异体T细胞刺激所引起的副作用。K562细胞经由基因工程化表达HLA-A、肿瘤抗原、其他免疫分子等已经发展为一种用于扩增用于临床免疫治疗的抗原非特异性或特异性T细胞的人工APC[13,14]。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术的第一个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗。本专利技术的第二个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法本专利技术的第三个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗在制备抗慢性病毒性炎症、抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体及其制备方法。本专利技术的第五个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及其制备方法。本专利技术的技术方案如下：由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体亦称囊泡(exosome；EXO)所构建的T细胞疫苗，包含治疗有效量的由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及药用载体；所述由基因工程化的一种特殊的人造抗原提呈细胞通过载体将基因转染到K562细胞而达到基因工程的转化，所述载体可以包括真核质粒载体和/或病毒载体；所述分泌小体由所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌；所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞。所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞，其有如下步骤制备而成：通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染缺乏内源性表达HLA-A,B和DR分子的K562细胞后，并用腺病毒载体再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1Gag、CD80和41BBL的人工APCK562A2/Gag/CD80/41BBL。根据本专利技术所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，所述K562细胞也可经由lentiviral载体将多个转基因转染从而形成K562A2/Gag/CD80/41BBL，由K562A2/Gag/CD80/41BBLEXO制备的EXO靶向T细胞疫苗可用于治疗HIV-1病人；K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有肿瘤抗原在内的多个转基因转染。从而形成基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗肿瘤的病人；K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有不同类别的组织相容抗原复合体在内的多个转基因转染，从而形成工程基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗相应的HLA-A1+，或HLA-A2+，或HLA-A3+的病人。本专利技术还提供一种上述由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体。本专利技术还提供一种上述由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体及其制备方法，通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染缺乏内源性表达HLA-A,B和DR分子的K562细胞后，并用腺病毒载体再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1Gag、CD80和41BBL的人工APCK562A2/Gag/CD80/41BBL，由APCK562A2/Gag/CD80/41BBL分泌的小体。本专利技术还提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞；所述分泌小体由上述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌。本专利技术还提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体所构建的T细胞的制备方法。本专利技术还提供一种所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)通过重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：包含由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及药用载体；所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞通过载体将基因转染到K562细胞而达到基因工程的转化，所述载体可以包括真核质粒载体和/或病毒载体；所述分泌小体由所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌；所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞。

【技术特征摘要】
1.由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：包含由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及药用载体；所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞通过载体将基因转染到K562细胞而达到基因工程的转化，所述载体可以包括真核质粒载体和/或病毒载体；所述分泌小体由所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌；所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞。2.根据权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：其由如下步骤制备而成：通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染一种特殊的缺乏内源性表达HLA-A,B和DR分子的K562细胞后，并用腺病毒载体再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1Gag、CD80和41BBL的人工APCK562A2/Gag/CD80/41BBL。3.根据权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：所述K562细胞也可经由lentiviral载体将多个转基因转染从而形成K562A2/Gag/CD80/41BBL，由K562A2/Gag/CD80/41BBLEXO制备的EXO靶向T细胞疫苗可用于治疗HIV-1病人；K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有肿瘤抗原在内的多个转基因转染。从而形成基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗肿瘤的病人；K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有不同类别的组织相容抗原复合体在内的多个转基因转染，从而形成工程基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗相应的HLA-A1+，或HLA-A2+，或HLA-A3+的病人。4.一种权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体。5.一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体所构建的T细胞，其特征在于：由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞；所述分泌小体由权利要求1或2所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌。6.一种根据权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcD...

【专利技术属性】
技术研发人员：项建华，
申请(专利权)人：项雯华，
类型：发明
国别省市：上海,31