海带孢子体幼苗PCR模板制备方法及扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种快速制备海带孢子体幼苗PCR模板的方法及PCR模板扩增方法，取海带孢子体幼苗，剪取叶片放入离心管中；加入蒸馏水浸泡幼苗叶片，对幼苗叶片进行充分研磨；离心；将上清液转移至新的离心管中作为PCR反应模板进行扩增。本发明专利技术在常规提取基因组DNA进行PCR检测的基础上，步骤明显简化，无需使用各种试剂及试剂盒，无需进行基因组DNA的提取，直接将海带孢子体幼苗研碎，离心后取上清直接进行PCR扩增，方法简便，结果明确，省去了大量人力、物力、财力，并大大减少了对环境和实验人员的污染和伤害。

Preparation and amplification of PCR template for spores of Laminaria japonica

The invention discloses a rapid method for preparing PCR template of kelp sporophyte seedlings and a PCR template amplification method. The kelp sporophyte seedlings are taken, the leaves are cut and placed in a centrifugal tube; the leaves of the seedlings are soaked in distilled water, and the leaves of the seedlings are fully ground; centrifuged; the supernatant is transferred to a new centrifugal tube for PCR reaction. Template amplification. On the basis of conventional extraction of genomic DNA for PCR detection, the steps of the invention are obviously simplified, without using various reagents and kits, and without genomic DNA extraction, the kelp sporophyte seedlings are directly grinded, and the supernatant is taken after centrifugation for PCR amplification. The method is simple, the results are clear, and a great deal of manpower and labor are saved. Material and financial resources, and greatly reduced pollution and injury to the environment and laboratory personnel.

【技术实现步骤摘要】
海带孢子体幼苗PCR模板制备方法及扩增方法
本专利技术属于分子生物学领域。具体涉及一种快速制备海带孢子体幼苗PCR模板的方法，还涉及所述PCR模板的扩增方法。
技术介绍
海带是一种典型的具有异性世代交替生活史的重要经济海藻，其配子体和孢子体形态差异显著。培育高产抗逆新品种，为养殖户提供优质苗种是保障产业链可持续发展的重要前提。在海带的实际生产过程中，通常是在育苗车间进行孢子体幼苗的培育，待幼苗长至2-3cm，并且海况条件合适后下海暂养；待幼苗长至30-40cm后，进行分苗，将幼苗夹到养殖绳上挂到养殖海区进行生产性养殖。近年来，结合分子标记技术，针对海带进行了大量群体遗传多样性和遗传结构分析、亲缘关系分析、种质鉴定等相关工作，选用的材料主要是海带不同生长阶段的孢子体。随着分子生物学的快速发展，传统生物学的研究手段得到了巨大的扩展，PCR技术作为核酸水平研究的主要工具具有特异性强、灵敏度高、快速简便、重复性好等特点，变得越来越重要，可以在获得物种基因组DNA的前提下，短时间内在体外将特定DNA序列从几个拷贝扩增到几百万倍的水平。传统的基因组DNA提取方法主要包括裂解法、试剂盒法及衍生出的一系列改良方法。但这些方法往往在准备阶段需要配制各种试剂及缓冲液，提取前需要将样品在液氮中研磨粉碎，而后进行多次抽提、沉淀、纯化。操作过程中用到的部分试剂具有一定毒性，会对环境及实验人员造成一定的负面影响；实验步骤繁琐，人力物力成本较高；对材料的取样量有一定要求，需要将实验材料培养至一定生物量后方能进行实验。在海带新品种培育的过程中，相关的遗传学分析及分子生物学评价等工作贯穿整个苗种繁育和生产性养殖周期，早期的工作由于孢子体材料大小的限制往往难以开展。在早期评价过程中，快速获得大样本量的海带孢子体幼苗PCR模板是提升工作效率的关键，传统的DNA提取方法耗时长、效率低，不适用于大量样品的快速分析评价。对原有海带孢子体幼苗的分析鉴定一般采用传统的CTAB法提取海带基因组DNA后，再选取适于海带分析的PCR引物进行扩增检测。DNA提取步骤主要包括：海带孢子体幼苗于液氮条件下迅速研磨至粉末状，将粉末迅速移至提取缓冲液，震荡混匀；55℃消化2h，期间每0.5h颠倒混匀一次，离心；将上清液移取至另一离心管，加入酚、氯仿和异戊醇（25：24：1），颠倒混匀10min，离心；将上清液移取至另一离心管，加入氯仿和异戊醇（24：1），颠倒混匀10min，离心；将上清液移取至另一离心管，缓慢加入预冷的异丙醇，-20℃过夜；离心；弃上清后加入预冷的无水乙醇缓慢颠倒洗涤沉淀，离心；弃上清并吹干乙醇，用蒸馏水溶解，置于4℃冰箱中保存。上述方法原理：海带孢子体的遗传构成分析以及群体多样性分析实验中，通常需要依赖PCR扩增，首先需要进行植物组织DNA的提取。传统的DNA提取方法又被称为CTAB法，CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。上述方法缺陷：1）、只能通过基因组DNA的提取来进行后续PCR检测，首先提取过程需要耗费一定时间；其次会产生实验试剂与实验用品的消耗；再次中间用到巯基乙醇、酚、氯仿等有机试剂，对实验人员和环境都不利。2）、进行基因组DNA的提取时，对材料的取样量有一定要求，早期海带孢子体幼苗很小，且提取过程中有一定损耗，往往无法满足后续实验的取样量要求。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种海带孢子体幼苗PCR模板制备方法及扩增方法，用于克服现有方法的不足，不采用任何有毒试剂，通过简易步骤快速得到供后续PCR反应的模板；同时只需要极少量的样品即可完成相关实验，用以解决样品取样量不足的困扰。本专利技术的技术方案如下：一种海带孢子体幼苗PCR模板制备方法，其特征在于按照以下步骤制备：取海带孢子体幼苗，剪取叶片放入离心管中；加入蒸馏水浸泡幼苗叶片，对幼苗叶片进行充分研磨；离心；将上清液转移至新的离心管中作为PCR反应模板。优选的步骤：1）、取海带孢子体幼苗用滤纸吸净水分并擦拭干净，剪取（1-2mm）×（2-4mm）大小的叶片放入1.5mL离心管中；2）、加入40-60μLddH2O浸泡幼苗叶片并用1.5mL离心管专用研磨棒进行反复研磨，直至ddH2O中无孢子体组织块存在；3）、在5000-7000rpm条件下常温离心4-6分钟；4）、吸取上清液转移至新的离心管中作为PCR反应模板。进一步地：其中步骤1）叶片大小1mm×2mm；步骤2）中加入ddH2O的量为50μL；步骤3）以6000rpm常温离心5分钟。对得到的PCR反应模板进行扩增的方法，其特征在于：对PCR反应模板直接进行PCR扩增或将PCR反应模板在4℃下保存一段时间再进行PCR扩增；所述的一段时间不超过48h。优选地：PCR扩增体系共20μL，包括2×PCRsupermix10μL、ddH2O7μL、10umol/L上下游引物各1μL、PCR反应模板1μL。优选地：PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性30s，58-63℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸5min，10℃保温。优选地：还包括以下步骤：取PCR扩增产物6μL，在12V/cm电压下，利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，制胶时加入核酸染料，用量为10μL核酸染料储液/100mL胶，电泳完毕后，在凝胶成像系统下观察条带情况。本专利技术中，PCRSuperMix属于PCR预混液，含DNAPolymerase，dNTPs和优化的反应缓冲液。购买于北京全式金生物技术有限公司。本专利技术所用核酸染料Gelstain购买于北京全式金生物技术有限公司。本专利技术的积极效果在于1、本专利技术在常规提取基因组DNA进行PCR检测的基础上，步骤明显简化，无需使用各种试剂及试剂盒，无需进行基因组DNA的提取，直接将海带孢子体幼苗研碎，离心后取上清直接进行PCR扩增，方法简便，结果明确，省去了大量人力、物力、财力，并大大减少了对环境和实验人员的污染和伤害。2、此方法摸索了取样面积，一方面对于特别小的海带孢子体幼苗，只需要很小的量就可以完成本实验。反之，如果进行基因组DNA提取的话，苗体太小，组织量无法满足基因组DNA提取的要求；另一方面，对于其他类似的褐藻，只要取样厚度及面积与本实验中最优条件描述相差不大，此方法都可通用。附图说明图1是由左至右排列的、分别用18S1、Zspj38、ZpsjE45、ZpsjE52引物检测海带孢子体幼苗DNA的凝胶电泳图。图2是用18S1引物检测不同大小取样组织的海带孢子体幼苗DNA的凝胶电泳图。图3、图4、图5分别是用18S1引物检测制备模板不同保存时间（图3为直接进行扩增、图4为保存24h、图5为保存48h）的海带孢子体幼苗DNA的凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海带孢子体幼苗PCR模板制备方法，其特征在于按照以下步骤制备：取海带孢子体幼苗，剪取叶片放入离心管中；加入蒸馏水浸泡幼苗叶片，对幼苗叶片进行充分研磨；离心；将上清液转移至新的离心管中作为PCR反应模板。

【技术特征摘要】
1.一种海带孢子体幼苗PCR模板制备方法，其特征在于按照以下步骤制备：取海带孢子体幼苗，剪取叶片放入离心管中；加入蒸馏水浸泡幼苗叶片，对幼苗叶片进行充分研磨；离心；将上清液转移至新的离心管中作为PCR反应模板。2.根据权利要求1所述的海带孢子体幼苗PCR模板制备方法，其特征在于按照以下步骤制备：1）、取海带孢子体幼苗用滤纸吸净水分并擦拭干净，剪取（1-2mm）×（2-4mm）大小的叶片放入1.5mL离心管中；2）、加入40-60μLddH2O浸泡幼苗叶片并用1.5mL离心管专用研磨棒进行反复研磨，直至ddH2O中无孢子体组织块存在；3）、在5000-7000rpm条件下常温离心4-6分钟；4）、吸取上清液转移至新的离心管中作为PCR反应模板。3.根据权利要求2所述的海带孢子体幼苗PCR模板制备方法，其特征在于：其中步骤1）叶片大小1mm×2mm；步骤2）中加入ddH2O的量为50μL；步骤3）以6000rpm常温离心5分钟。4.对权利要求1或2或3得到的PCR反应模板进行扩增的方法，其特征在于：对PCR反应模板直接进行PCR扩增或将PCR反应模板在4℃下保存一段时间再进行PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭捷，姜黎明，刘延岭，李言，李晓捷，田萍萍，张壮志，潘金华，孙娟，史良，
申请(专利权)人：山东东方海洋科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37