一种油菜转基因成分的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种油菜转基因成分的检测方法，包括以下步骤：确定转基因成分、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；进行抽样并混合，得到混合样品；提取混合样品的基因组并加入外源标准基因，得到混合核酸；构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；获得待测样品中转基因成分的测序片段的数量；待检样品DNA在引物、Bst DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；根据外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功并计算待测样品种中转基因成分的含量；根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分。本发明专利技术能够同时定量检测待测样品中的任意多种转基因成分。

A method for detection of transgenic components in rape

The invention discloses a detection method for genetically modified components of rape, which comprises the following steps: determining the genetically modified components, endogenous standard genes and exogenous standard genes; preparing multiplex amplified primers; sampling and mixing to obtain mixed samples; extracting the genome of mixed samples and adding exogenous standard genes to obtain mixed nuclei. Acids; construction of high-throughput sequencing library; high-throughput sequencing library to obtain sequence fragment groups; to obtain the number of sequencing fragments of transgenic components in the samples to be tested; DNA of the samples to be tested in the presence of primers, Bst DNA polymerase isothermal amplification reaction; according to the exogenous standard gene sequencing fragments Quantity, determine whether the experiment is successful and calculate the content of GM components in the samples to be tested; according to the content of GM components to determine whether the samples to be tested contain GM components. The invention can simultaneously detect any variety of genetically modified ingredients in the sample to be tested simultaneously.

【技术实现步骤摘要】
一种油菜转基因成分的检测方法
本专利技术涉及生物检测
，具体为一种油菜转基因成分的检测方法。
技术介绍
油菜是我国主要作物，油菜转基因技术与产品均已成熟，需要对转基因油菜的推广进行监管，转基因成分检测是转基因监管的技术支撑。现有的转基因成分检测技术主要检测核酸或蛋白质，其中，基于核酸的检测方法主要流程为：提取待测样品中的核酸，利用PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应)的方法扩增样品中的转基因成分，利用实时定量、琼脂糖电泳或芯片技术检测转基因成分是否存在。转基因成分多种多样，而现有技术一次只能检测其中一种或少数几种，因此，需要对可能的多种转基因成份逐一进行检测，才能确定为“非转基因”产品；一般检测的是共转化的转基因成分，而不是外源基因本身，因此，对于无标记转基因来说，采用现有的检测方法进行检测会失效；检测基本上是定性检测，但定量检测又有其现实需求，例如，相邻田块的转基因油菜品种的少量花粉被传到了非转基因品种上，在定性检测时，非转基因品种将被误判为转基因品种。
技术实现思路
本专利技术提供一种油菜转基因成分的检测方法，可以有效解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种油菜转基因成分的检测方法，包括以下步骤：S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为油菜植株或所述油菜植株的一部分；S2、制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；S3、对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；S4、提取所述混合样品的基因组；S5、向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；S6、利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；S7、对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；S8、分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；S9、待检样品DNA在引物、BstDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；S10、结合所述外源标准基因的测序片段的数量以及根据扩增结果判断待检样品中是否存在转基因成分，判断实验是否成功；S11、若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；S12、根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。进一步的，所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种。进一步的，所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。进一步的，所述外源标准基因不存在于所有生物中。进一步的，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值。进一步的，所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任意一种所述转基因成分的含量≥α2时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转基因成分的含量<α2时，判定所述待测样品不含有转基因成分；其中，α2为判定阈值。进一步的，计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为：第m种所述转基因成分的含量的计算公式为其中，i为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域，n1为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数，bi为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第j种所述测试区域的所述测序片段的数量；N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。进一步的，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术提供的检测方法可以在不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，可以一次性检测任意多种需要检测的转基因成分，从而判定待测样品是否含有转基因成分，该方法可以实现定量检测，且检测结果几乎没有下限，结果准确可靠，是现有技术达不到的。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例：通过农杆菌介导法将双丙氨酰磷抗性(Biolaphosresistance，Bar)基因导入湘油15油菜品种，自交纯化3代后，获得改造的湘油15油菜品种种子，作为本实施例的待测油菜品种。其中，湘油15油菜是转基因油菜受体品种，由湖南农业大学油料所育成，本实施例中使用的湘油15油菜种子由湖南农业大学油料所保存和繁殖。油菜植物品种转基因成分检测方法，具体步骤如下：S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、待测样品中的内源标准基因和待测样品的外源标准基因，具体方法如下：待测样品为油菜植株或油菜植株的一部分，其中，油菜植株可以为油菜植株的根、茎、叶、花、果实和种子等器官，也可以是2种及2种以上的不同器官的混合物，如叶和茎的混合物，油菜植株的一部分可以为油菜植株的根、茎、叶、花、果实和种子等至少一个器官中的一部分。在本实施例中，待测样品为改造后的湘油15油菜的种子，转基因成分、内源标准基因和外源标准基因均≥1个，转基因成分可以为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种，即通过转基因技术手段向湘油15油菜品种中转入不存在于湘油15油菜品种中的外源核酸序列；内源标准基因为待测样品的基因组中的单拷贝基因。在本实施例中，内源标准基因通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在待测样品基因组上比对时为单一序列；外源标准基因不存在于所有生物中，在本实施例中，所使用的外源标准基因为ERCC04基因，其在NCBI上同源比对时，未发现同源序列，可以判定外源标准基因不存在于所有生物中。在本实施例中，检测的转基因成分共5种，内源标准基因1种，外源标准基因1种，转基因成分不仅包括Bar基因，Bar基因为外源功能基因，还包括其他转基因成分，这些转基因成分在转基因作物中广泛使用，因此，本实施例提供的检测方法具有通用性。基因序列有两种表示方式，一种是直接写出基因序列，另一种是NBCI的基因编号，测序区域中的数字代表碱基的位置，该基因的第1个碱基的位置定义为1。S2、制备用于扩增转基因成分、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引物，具体方法如下：多重扩增引物的获取过程如下：登录赛默飞世尔公司多重PCR引物在线设计网页https://ampliseq.com/，在“Applicationtype”选项选择“DNAHotspotdesigns(single-pool)”。若选择multi-pool，则多重PCR将分多管进行，成本会有所增加，而single-pool的引物只需要一次多重PCR即可，节省成本，所以本实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,包括以下步骤：S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为油菜植株或所述油菜植株的一部分；S2、制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；S3、对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；S4、提取所述混合样品的基因组；S5、向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；S6、利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；S7、对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；S8、分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；S9、待检样品DNA在引物、Bst DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；S10、结合所述外源标准基因的测序片段的数量以及根据扩增结果判断待检样品中是否存在转基因成分，判断实验是否成功；S11、若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；S12、根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。...

【技术特征摘要】
1.一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,包括以下步骤：S1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为油菜植株或所述油菜植株的一部分；S2、制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；S3、对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；S4、提取所述混合样品的基因组；S5、向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；S6、利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；S7、对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；S8、分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；S9、待检样品DNA在引物、BstDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；S10、结合所述外源标准基因的测序片段的数量以及根据扩增结果判断待检样品中是否存在转基因成分，判断实验是否成功；S11、若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；S12、根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。2.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种。3.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方法，其特征在于,所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。4.根据权利要求1所述的一种油菜转基因成分的检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振乾，程潜，官春云，熊兴华，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43