用于检测和鉴定生物样品中的核酸序列的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及用于检测和鉴定生物样品中的核酸序列的组合物和方法。本发明专利技术涉及用于分离、检测、扩增和定量生物样品中病原体特异性核酸的组合物和方法。本发明专利技术还提供含有特异性扩增引物和与从其获得的扩增产物特异性结合的标记的检测探针的诊断试剂盒。还公开了用于从种类广泛的样品(包括生物、环境、临床和/或兽医来源的样品)分离对于一种或多种病原体(包括，例如流感病毒和结核分枝杆菌)特异性的核酸和表征其的组合物和方法。

Compositions and methods for detection and identification of nucleic acid sequences in biological samples

The invention relates to compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples. The present invention relates to compositions and methods for isolation, detection, amplification and quantification of pathogen specific nucleic acids in biological samples. The present invention also provides diagnostic kits containing specific amplification primers and labeled detection probes specifically binding to amplified products obtained therefrom. Compositions and methods for isolating and characterizing specific nucleic acids for one or more pathogens, including influenza viruses and Mycobacterium tuberculosis, from a wide range of samples, including biological, environmental, clinical and/or veterinary sources, are also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
用于检测和鉴定生物样品中的核酸序列的组合物和方法本申请是国际申请日为2012年4月26日的国际申请PCT/US2012/035253进入中国、申请号为201280031236.0的题为“用于检测和鉴定生物样品中的核酸序列的组合物和方法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术总体涉及用于检测、鉴定和任选定量分离的多核苷酸群体诸如从生物样品中获得的分离的多核苷酸群体内的核酸区段的组合物和方法。具体而言，本专利技术的组合物和方法可以在环境温度维持长时间而不损害组分的完整性或分析的保真度。
技术介绍
分枝杆菌是单细胞、需氧的革兰氏阳性细菌。通常，分枝杆菌具有厚疏水性细胞壁且缺乏外细胞膜。分枝杆菌引起的感染在宿主内可以是活跃的，或潜伏且无症状的。多药耐药菌株的出现，对延长的抗菌治疗的需求和患者的差依从性，使得分枝杆菌感染的治疗变得困难，特别是在发展中国家中。具体而言，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的多药耐药(MDR)菌株的出现已经使TB的诊断和治疗在发展中非洲人群中变得高度优先。分枝杆菌通常由于其缺乏外细胞膜而被归类为抗酸革兰氏阳性细菌。经常使用的抗酸染色方法是Ziehl-Neelsen染色或Kinyoun方法。它们通常无法很好地保留结晶紫染色，因此不被认为是革兰氏阳性细菌的典型代表。然而，它们的确含有独特的细胞壁结构，所述细胞壁结构比大多数其他细菌物种中存在的细胞壁结构更厚。通常，杆形细胞壁由疏水霉菌酸酯层(含有霉菌酸)和通过阿拉伯半乳聚糖(一种多糖)保持在一起的肽聚糖层组成。该细胞壁结构有助于分枝杆菌在环境急剧变化之后存活的能力，并且有助于分支杆菌物种的耐寒性，以及在治疗结核病和麻风病患者(这两者都是由不同分枝杆菌物种引起的)中的难度。霉菌酸是形成生物体周围的脂质壳并且影响在细胞表面的渗透性特性的强疏水性分子。霉菌酸被认为是在一些分枝杆菌物种中显著的毒力决定因素。最可能地，它们防止阳离子蛋白、溶菌酶和吞噬颗粒中的氧自由基对分枝杆菌的攻击。它们还保护细胞外分枝杆菌免于血清中的补体沉积。此外，分枝杆菌典型地是缓慢生长的生物体，这促进了培养物种的难度。由于它们独特的细胞壁，它们在长期暴露于酸类、碱类、去污剂类、氧化爆发、补体裂解、和许多抗生素之后可以存活。大多数分枝杆菌易受抗生素克拉霉素和利福霉素的影响，但已经出现了抗生素耐药菌株。结核分枝杆菌复合群的成员，即，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、M.cannetti、M.caprae和M.pinnipedi，结核病的病原体，具有分枝杆菌的所有上述特征。在人中分枝杆菌感染(和特别是分枝杆菌属的一种或多种物种的感染)的主要后果是结核病(TB)，这是“结核分枝杆菌复合群”的成员引起的接触性感染，所述“结核分枝杆菌复合群”的成员包括，例如，物种的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、M.cannetti、M.caprae和M.pinnipedi的致病性菌株。结核病通常攻击哺乳动物宿主的肺部，但也可以扩散到机体的其他器官和区域，包括，例如，骨、关节、肾脏和腹部等。结核分枝杆菌复合群的成员在遗传上密切相关，并且在属间具有高度保守的16SrRNA序列。TB可以通过在来自受感染人的咳嗽或喷嚏的空气液滴中呼吸而获得。因此，收集怀疑含有结核分枝杆菌复合群的成员的生物样品包括收集来自怀疑被其感染的患者的痰。痰是来自呼吸道的咳出痰，并且理想地含有很少或几乎不含唾液或鼻分泌物，以避免口腔细菌污染痰样品。痰主要含有粘液，这是富含糖蛋白的粘性胶体。怀疑具有结核病的患者通常具有增加的粘液粘度，以及增加的粘液产生。除了粘液，痰可含有血液，即可能出现咯血，和/或脓液，即，本质上是脓性的。活跃结核感染的症状可以包括慢性咳嗽(通常痰中带血)、发热、夜间多汗症、慢性疲劳、苍白、体重下降、恶病质性浪费(cachecticwasting)(“消耗”)。其他症状可以包括呼吸困难、胸痛和气喘(“PulmonaryTuberculosis,”PubMedHealth)。如果吸入的结核杆菌居于肺部肺泡，则发生感染，随后是肺泡毛细管扩张和内皮细胞肿胀。肺泡炎导致结核杆菌的细胞内复制和多形核白细胞进入肺泡。生物体然后通过淋巴系统扩散到循环系统，然后扩散到整个身体。尽管结核分枝杆菌在美国每年感染少于200,000人，但是根据世界卫生组织(WHO)，全球近二十亿人可能被感染，其中90％在感染后可以维持多年无症状。如果不进行治疗，TB在>50%的受感染群体中是致命的，并且在该疾病的散播性形式中，死亡率接近90％。因为TB感染慢性且持久虚弱，所以与一种或多种第二种病原体(特别包括人免疫缺陷病毒(HIV))的共感染也是普遍的。在2007年，有至少1.37百万例HIV-阳性TB，主要集中在其中诊断和治疗往往有限、无效和/或成本高昂的出现群体中。TB感染的常规诊断通常依赖于体检(例如，慢性持续性咳嗽，扩大或脆弱淋巴结，胸腔积液，异常呼吸音，并且，在疾病的后期阶段，手指或脚趾的特征性“杵状指(clubbing)”)和诊断测试(例如，痰液检查，样本的微生物培养和核酸检测，支气管镜检，胸部的CT扫描或X射线，肺活检，胸腔穿刺术，干扰素-γ(gamma)血液测试和结核菌素皮肤试验)的组合。TB诊断的“标准”，分枝杆菌生物体的细胞培养，是困难的，部分原因是它们的传代时间长，即对于结核分枝杆菌为24小时。此外，分枝杆菌通常以低水平存在于受感染的个体中。因此，从临床样本培养可花费四至八周之间的任何时间，在该时间期间，患者可能变得病重并感染给其他人。此外，细胞培养需要收集、运输和保存样品中的活分枝杆菌生物体，直至诸如可以在实验室环境中分析样品的时间。在TB流行和健康护理极少的国家中，这可能不是一个选项，因此增加了传播感染的风险。不幸的是，对于医疗护理获得受限的地区，全血必须在获得样品的12小时内进行分析，并且还没有对具有其他医疗状况(诸如HIV、AIDS、糖尿病、矽肺病、慢性肾衰竭、血液病症)的患者、已经对TB感染进行治疗的个体分析测试的有效性，也没有对怀孕个体或未成年人进行过测试(“CliniciansGuidetoQuantiFERON®-TBGold,”Cellestis)。其他非培养方法，诸如放射免疫测定法、胶乳凝集法和酶联免疫吸附测定(ELISA)对于证实生物样品中结核杆菌的存在的使用的成功程度有限。大多数临床诊断实验室采用传统培养用于病原体鉴定，这对于大多数病毒通常需要3-7天，并且对于一些细菌菌株需要更长时间，包括用于培养结核分枝杆菌的多达约21天。传统培养需要活微生物的样本收集、冷冻运输、和潜在感染性和经常未知生物微生物的传播和处理。此外，许多感染性物质，例如，高度致病性禽流感、SARS、结核分枝杆菌复合群等是BSL-3级病原体，其需要专门设施和注意事项进行分析。在获得、运输和保持高质量活生物样本进行培养中存在挑战。样本必须使用冷链(最常见干冰)进行运输。使用商业运输从远处或跨国界运输潜在感染性样品可能是昂贵且繁琐的，特别是当样品必本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测生物样品中的结核分枝杆菌复合群的成员的PCR即用组合物，其包含组分：以0.1 mM至1 mM的浓度共同存在于所述组合物中的包含基本上等量的dATP、dCTP、dGTP 和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；以0.01 mM至1 mM的浓度存在于所述组合物中的选自乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N‑双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、和它们的任何组合的螯合剂；以1 mM至1 M的浓度存在于所述组合物中的PCR摩尔渗透压浓度试剂N,N,N‑三甲基甘氨酸(甜菜碱)；选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、山羊血清白蛋白、哺乳动物白蛋白、和它们的任何组合的白蛋白；以50 mM至1 M的浓度共同存在于所述组合物中的至少两种盐，第一种是选自氯化钾和谷氨酸钾的钾盐，且第二种是选自氯化镁和硫酸镁的镁盐；和以1 mM至1 M的浓度存在于所述组合物中的选自三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2‑(N‑吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N‑双(2‑羟基乙基)‑2‑氨基乙磺酸(BES)、1,3‑双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(Bis‑Tris)、4‑(2‑羟基乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸(HEPES)、3‑(N‑吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N‑双(2‑羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N‑[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N‑2‑乙酰胺基‑2‑亚氨基二乙酸(ADA)、N‑(2‑乙酰胺基)‑2‑氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪‑1,4‑双(2‑乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐和它们的任何组合的缓冲剂，pH为6.5至9.0，其中所述缓冲剂的pKa 在环境温度下的所述组合物的pH 的一个单位之内，其中所述组分与不含核酸酶的水相组合；且其中所述组合物包含一种或多种染料；以0.05U至1 U的量存在的热稳定聚合酶；与对结核分枝杆菌复合群的成员特异性的PCR扩增的核酸序列结合的标记的检测探针，其中所述标记的检测探针是20个至35个核苷酸长度的分枝杆菌特异性序列，并且包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 7的序列；以及配置成通过PCR扩增对结核分枝杆菌复合群的成员特异性的核酸序列的PCR引物对，所述PCR引物对以0.5 µM至50 µM的浓度共同存在于组合物中，其中各PCR引物为18个至35个核苷酸长度。...

【技术特征摘要】
2011.04.26 US 13/0948091.用于检测生物样品中的结核分枝杆菌复合群的成员的PCR即用组合物，其包含组分：以0.1mM至1mM的浓度共同存在于所述组合物中的包含基本上等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；以0.01mM至1mM的浓度存在于所述组合物中的选自乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、和它们的任何组合的螯合剂；以1mM至1M的浓度存在于所述组合物中的PCR摩尔渗透压浓度试剂N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)；选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、山羊血清白蛋白、哺乳动物白蛋白、和它们的任何组合的白蛋白；以50mM至1M的浓度共同存在于所述组合物中的至少两种盐，第一种是选自氯化钾和谷氨酸钾的钾盐，且第二种是选自氯化镁和硫酸镁的镁盐；和以1mM至1M的浓度存在于所述组合物中的选自三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N-2-乙酰胺基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐和它们的任何组合的缓冲剂，pH为6.5至9.0，其中所述缓冲剂的pKa在环境温度下的所述组合物的pH的一个单位之内，其中所述组分与不含核酸酶的水相组合；且其中所述组合物包含一种或多种染料；以0.05U至1U的量存在的热稳定聚合酶；与对结核分枝杆菌复合群的成员特异性的PCR扩增的核酸序列结合的标记的检测探针，其中所述标记的检测探针是20个至35个核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：GW费希尔，LT道姆，
申请(专利权)人：长角牛疫苗和诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US