一种无血清口腔黏膜上皮细胞培养液及应用制造技术

本发明专利技术提供一种无血清口腔黏膜上皮细胞培养液及应用，本发明专利技术的培养液包括基础培养液(F12，无钙DMEM，K‑SFM)、必须补充因子、细胞生长因子、细胞增殖分化的调节因子等。本发明专利技术无血清的培养液，通过添加各种细胞增殖分化调节因子及其他成分，尤其是骨形态发生蛋白(BMP‑4)，既满足口腔黏膜上皮细胞的高密度增殖的需要，同时又避免了上皮细胞过度分化而导致的细胞增殖抑制现象，从而能有效的平衡体外口腔黏膜上皮细胞的增殖及分化速度，降低细胞的倍增时间，满足大规模的组织工程模型构建的需求。

A serum free oral mucosal epithelial cell culture medium and its application

The present invention provides a serum-free oral mucosal epithelial cell culture medium and its application. The culture medium of the present invention comprises a basic culture medium (F12, calcium-free DMEM, K_SFM), a necessary supplement factor, a growth factor, a regulatory factor for cell proliferation and differentiation, etc. The serum-free culture solution of the invention can not only meet the requirement of high-density proliferation of oral mucosal epithelial cells, but also avoid the phenomenon of cell proliferation inhibition caused by overdifferentiation of epithelial cells by adding various cell proliferation and differentiation regulators and other components, especially bone morphogenetic protein (BMP_4). Effectively balance the proliferation and differentiation of oral mucosal epithelial cells in vitro, reduce the doubling time of cells, to meet the needs of large-scale tissue engineering model.

【技术实现步骤摘要】
一种无血清口腔黏膜上皮细胞培养液及应用
本专利技术涉及一种无血清口腔黏膜上皮细胞培养液及应用，属于生物医学

技术介绍
口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科往往有大面积口腔黏膜缺损。自体黏膜移植修复是更为符合口腔生理要求，但组织来源有限，无法用于较大面积口腔内创面的修复，因而传统上多采用自体皮肤移植代替缺失的黏膜。皮肤移植修复口腔缺损的同时，存在着明显的缺陷：如口腔内移植的上皮仍保持皮肤上皮原有结构和功能，不会转变为黏膜，移植多年仍保持上皮角化、分泌、毛发生长等，患者感觉不舒服。近年来发展起来的组织工程技术为此问题的解决开辟了新途径。通过组织工程技术将自体表皮细胞在体外培养扩增而合成的人工皮肤目前已成功的应用于烧伤患者，因而可以同样利用该技术构建口腔黏膜来代替皮肤移植修复。构建口腔黏膜组织工程，首先除了要获得足量且纯化的上皮种子细胞外，最为重要的是建立一种可靠的黏膜上皮细胞体外培养扩增技术和方法。口腔粘膜上皮细胞的培养大多是参照皮肤KC的培养技术，早期多采用有血清培养基合组织块法，血清成分占10％-20％，有研究发现含血清10％的培养基成纤维细胞生长明显，对正常的口腔粘膜细胞造成严重的污染，影响口腔黏膜细胞在医学上的应用。随后许多口腔黏膜上皮细胞的培养采用酶解培养法，即用胰酶和DispassⅡ酶酶解方法分离口腔黏膜上皮细胞，然后以3T3作为滋养层的技术来进行，但由于该培养法利用血清培养基，血清中的某些成分可能对试验结果的分析产生影响，而且3T3作为异种蛋白可能对人也有不利的影响，强调在选择性手术中尽量不使用滋养层培养上皮细胞。为了避免使用滋养层，人们开发了多种方法；如培养皿表面涂细胞基质成分；不同浓度的钙和各种生物提取物的添加；促分裂物和微量元素的添加。研究者在加入血清的培养液中进行细胞培养时发现，部分单层上皮细胞出现复层并有角化物出现，说明血清成分对上皮细胞有诱导分化作用，提示细胞在扩增传代时加入血清可能使细胞传代次数减少，因而近年来逐步发展起来许多利用无血清培养基进行培养。然而由于传统的无血清培养基导致口腔黏膜上皮细胞生长缓慢、原有的干细胞特性下降、容易出现老化等一系列现象以及很难大量扩增的问题。因此，目前研究应用不含胎牛血清但辅以多种添加成分的复合培养基在体外培养口腔粘膜上皮细胞，探索体外连续培养口腔黏膜细胞的技术和方法，是当前本领域中依然需要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种不含血清的口腔黏膜上皮细胞培养液，包括角质细胞无血清培养液(K-SFM)，无钙的DMEM和F12培养基，并添加多种类型的细胞生长因子如EGF，牛垂体提取液(BPE)，氢化可的松等，以满足无血清培养的细胞能在体外大量增殖的需要；特别是本专利技术培养液中添加骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticproteins4，BMP-4)，可以使细胞稳定增殖传代，并能避免细胞分化，使得口腔粘膜上皮细胞大量扩增。本专利技术无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，包括基础培养液、必须补充因子、细胞生长因子以及细胞增殖分化的调节因子，所述基础培养液为角质细胞无血清培养液K-sfm、无钙的DMEM、Ham’sF-12培养基，体积比为2:1:1；所述细胞增殖分化的调节因子包括骨形态发生蛋白-4，其终浓度为1-50ng/ml。所述必须补充因子包括胰岛素、双抗、L-谷氨酰胺、乙醇胺；所述细胞生长因子包括表皮生长因子、胰岛素生长因子、转化生长因子-β；所述细胞增殖分化的调节因子包括BMP-4、氢化可的松、牛垂体提取物、氯化钙、ROCK激酶抑制剂、霍乱毒素；所述双抗为青霉素-链霉素。本专利技术所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，以500ml计，其组分及用量如下：角化细胞无血清培养液(K-sfm，keratinocyteserum-freemedium)250ml；无钙DMEM培养液125ml；Ham’sF-12培养基125ml；表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)：终浓度为1-10ng/ml；胰岛素生长因子：终浓度为1-20ug/ml；氢化可的松(Hydrocortisone)：终浓度为2-10ug/ml；牛垂体提取物(BovinePituitaryExtract,BPE)：终浓度为5-50μg/ml；转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)：终浓度为0.2-2ng/ml；L-谷氨酰胺：终浓度为200mM(100X)；胰岛素：终浓度为1-15ug/ml；骨形态发生蛋白-4(Bonemorphogeneticproteins4，BMP-4)：终浓度为1-50ng/ml；100X青霉素-链霉素(Penicillin/Streptomycin,PS)：终浓度为1X；氯化钙溶液(CaCl2)：终浓度为0.1-5M；ROCK激酶抑制剂Y27632：终浓度为1-20uM；霍乱毒素：终浓度为0.1-10nM；乙醇胺(Etha)：终浓度为1×10-5-10×10-5mol/L。本专利技术无血清口腔黏膜上皮细胞培养液的制备方法是：以500ml计，步骤如下：(1)准确称取F12粉末，倒入装有400ml去离子水的烧杯中，将烧杯置于搅拌机上至其溶解，然后用量筒补齐至500ml，用0.22um的过滤器过滤，得F12培养液，备用；(2)取K-SFM培养液250ml，无钙DMEM培养液125ml，F12培养液125ml，震荡混匀；(3)配制必须补充因子、细胞生长因子以及细胞增殖分化调节因子的母液：(4)将(3)中配置的母液依次加入(2)中的基础培养液中，震荡混匀；(5)最后加入浓度为0.3M的CaCl2，并在培养基中加入100X青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺，混匀后吸取3ml做空白培养并观察染菌情况以进行后续实验，配制好的培养基用封口膜封口，4℃冰箱保存。本专利技术还提供所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液在体外构建3D模型中的应用。本专利技术提供的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液较传统无血清培养液的优点在于：(1)本专利技术首次在口腔黏膜上皮细胞培养液中添加BMP-4。该BMP-4在胚胎发育过程中对口腔黏膜的分化发育起重要作用，当外胚层细胞面临向神经细胞或表皮细胞分化做出选择时BMP-4通过使Sox-1阳性神经前体细胞发生细胞凋亡促进外胚层分化为表皮细胞。本专利技术人研究表明BMP-4是口腔黏膜细胞培养中关键的生长因子，能与其他细胞因子协同提供细胞生长的营养成分，可避免细胞在扩增培养时传代次数的减少。(2)实验表明本专利技术培养基较传统无血清培养基可最大限度延长传代次数，保持细胞干性，可最大程度避免细胞分化，使得口腔粘膜上皮细胞大量扩增。为细胞扩大培养提供可能性。(3)本专利技术无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，可用于体外构建3D模型。图9中可见细胞的复层结构，包括基底层、棘层、颗粒层、角质层，说明本专利技术的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，可以成功用于体外构建3D模型。说明本专利技术培养液的用途较现有的无血清培养基更为全面。附图说明图1为实验例1采用本专利技术的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液进行人口腔黏膜上皮原代细胞培养10天后的细胞形态(倒置相差显微镜，×100)。图2为实验例1采用传统无血清培养基MCDB153进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，包括基础培养液、必须补充因子、细胞生长因子以及细胞增殖分化的调节因子，其特征是，所述基础培养液为角质细胞无血清培养液K‑sfm、无钙的DMEM、Ham’s F‑12培养基，体积比为2:1:1；所述细胞增殖分化的调节因子包括骨形态发生蛋白‑4。

【技术特征摘要】
1.一种无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，包括基础培养液、必须补充因子、细胞生长因子以及细胞增殖分化的调节因子，其特征是，所述基础培养液为角质细胞无血清培养液K-sfm、无钙的DMEM、Ham’sF-12培养基，体积比为2:1:1；所述细胞增殖分化的调节因子包括骨形态发生蛋白-4。2.如权利要求1所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，其特征是，所述骨形态发生蛋白-4终浓度为1-50ng/ml。3.如权利要求2所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，其特征是，所述骨形态发生蛋白-4终浓度为15-50ng/ml。4.如权利要求1-3任一所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，其特征是，所述必须补充因子包括胰岛素、双抗、L-谷氨酰胺、乙醇胺；所述细胞生长因子包括表皮生长因子、胰岛素生长因子、转化生长因子-β；所述细胞增殖分化的调节因子包括BMP-4、氢化可的松、牛垂体提取物、氯化钙、ROCK激酶抑制剂、霍乱毒素。5.如权利要求4所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，其特征是，所述双抗为青霉素-链霉素。6.如权利要求5所述的无血清口腔黏膜上皮细胞培养液，其特征是，以500ml计，各组分及用量如下：角化细胞无血清培养液K-sfm250ml；无钙的DMEM培养液125ml；Ham’sF-12培养基125ml；表皮生长因子：终浓度为1-10ng/ml；胰岛素生长因子：终浓度为1-20ug/ml；氢化可的松：终浓度为2-10ug/ml；牛垂体提取物：终浓度为5-50μg/ml；转化生长因子-β：终浓度为0.2-2ng/ml；L-谷氨酰胺：终浓度为200mM；胰岛素：终浓度为1-15ug/ml；骨形态发生蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴训伟，邢志青，李霄，王红丽，张平，张甜甜，王杰，
申请(专利权)人：济南磐升生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37