一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，属于生物分析领域。这种分离方法包括：将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡‑脂质颗粒的复合物或融合物；再将细胞微囊泡‑脂质颗粒的复合物或融合物从生物样品中分离。该方法使用脂质颗粒捕获细胞微囊泡，克服了现有的脂质探针捕获法在分离细胞微囊泡时脂质分子在生物样品溶液中分散性差、易组装的缺陷，有效提高了细胞微囊泡的分离效率和纯度。

A method for separating cellular vesicles from biological samples

The invention provides a separation method for cell microvesicles in biological samples, belonging to the field of biological analysis. The separation method includes: the pretreated biological samples are mixed with lipid particles and incubated to form cell microvesicle lipid particles complex or fusion; and then the cell microvesicle lipid particles complex or fusion organism is separated from the biological samples. This method uses lipid particles to capture cell microvesicles, overcomes the shortcomings of poor dispersion and easy assembly of lipid molecules in biological sample solution, and effectively improves the separation efficiency and purity of cell microvesicles.

【技术实现步骤摘要】
一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法
本专利技术涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法。
技术介绍
研究人员发现，在许多液体生物样品中均含有多种膜包被的微囊泡，这类微囊泡内包含信使RNAs和microRNA等核酸类物质以及多种蛋白质。以外泌体为例，研究证实，外泌体可作为信使，通过血液、尿液、乳液、唾液等途径介导细胞间的信号转导，其内携带各种蛋白、核酸，甚至全基因组的DNA，因而外泌体内容物通常可以反映细胞健康或者疾病的状态，并且对周围细胞产生的影响，其在一定程度上反映了肿瘤等疾病的相关信息。由此，有效分离此类细胞微囊泡具有重要意义。目前，分离此类细胞微囊泡的方法主要有：1)超速离心法，这种方法需要采用昂贵的设备才能实现；2)聚合物沉淀法，其缺点在于所获得的杂蛋白过多，影响纯化过程；3)凝胶排阻法，其缺点在于分离效率低，产品纯度不高；4)脂质探针捕获法，该方法是使用偶联生物素的脂质分子与样品接触，脂质分子插入微囊泡的磷脂双分子层中，再用亲和素偶联的磁珠捕获生物素-脂质分子-微囊泡复合物。该方法的缺点是脂质分子在水溶液中分散性差，易自组装成脂质体。该方法的改进型是将脂质分子通过硅烷化修饰在玻璃基底上，缺点是硅烷化的效率有限，玻璃基底的表面积有限；5)正电膜捕获法，该方法是使用带正电的再生纤维素多孔膜、以及带正电的强阴离子交换树脂，捕获带负电的微囊泡，其缺点是纯度和分离效率有限。由上述分析可知，现有技术中分离细胞微囊泡的技术都各有局限性，无法满足研究需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，旨在提高细胞微囊泡的分离效率和纯度。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物；再将细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从生物样品中分离。与现有技术相比，本专利技术的有益效果例如包括：本专利技术提供的这种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，通过对生物样品进行预处理，去除生物样品中的细胞、细胞碎片以及团聚物，得到包含有细胞微囊泡的生物样品上清液；再将该生物样品上清液与脂质颗粒混合孵育，在孵育过程中，由于脂质颗粒的表面具有亲脂性的基团或表面具有正电荷，其能够通过亲和作用与上清液中的细胞微囊泡结合、或者与上清液中的细胞微囊泡相融合，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物；由于这种细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物的质量及分子大小均远大于细胞微囊泡，故可利用较为常规的分离技术，便可使细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物与上清液分离，得到携带有细胞微囊泡的复合物或融合物；可进一步将其裂解，从中提取核酸或蛋白质，用于多种生物分析中。该方法使用脂质颗粒捕获细胞微囊泡，克服了现有的脂质探针捕获法在分离细胞微囊泡时脂质分子在生物样品溶液中分散性差、易组装的缺陷，有效提高了细胞微囊泡的分离效率和纯度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实施例1所得细胞外囊泡的蛋白与标准超速离心法所得的细胞外囊泡的蛋白，同时进行Westernblot分析，得到的细胞外囊泡标志物含量的结果。图2为实施例2所得的外泌体RNA进行荧光定量PCR，得到的β-actinmRNA扩增曲线。图3为实施例2所得的外泌体RNA进行荧光定量PCR，得到的β-actinmRNA溶解曲线。图4为采用标准超速离心法所得的外泌体RNA，进行荧光定量PCR，得到的β-actinmRNA扩增曲线。图5为采用标准超速离心法所得的外泌体RNA，进行荧光定量PCR，得到的β-actinmRNA溶解曲线。图6为实施例2所得的外泌体RNA与标准超速离心法所得的外泌体RNA，同时进行荧光定量PCR，得到的β-actinmRNA相对含量统计结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，以获得高纯度的细胞微囊泡，并分离其携带的核酸或蛋白质进行常规生物分析。其中，细胞微囊泡为细胞所分泌、脱落或破碎后产生的，具有脂质膜结构。细胞微囊泡包括细胞外囊泡、微粒(100～1000nm)、脱落囊泡(100～1000nm)。其中，细胞外囊泡包括外泌体(40～150nm)、微囊泡(100～1000nm)、凋亡小体。其中，生物样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、汗液、精液、组织积液、细胞或组织培养物上清液。该分离方法包括以下步骤：步骤S1：将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。进一步的，生物样品的预处理方法包括：将生物样品进行过滤或离心，以去除样品中的细胞、细胞碎片和团聚物，得到生物样品上清液。优选的，过滤时选用0.2～0.8μm的滤膜，或0.3～0.7μm的滤膜，或0.4～0.6μm的滤膜。优选地，在1PA18000431SC～16000g、4～25℃下离心10～30min，或者为在12000～14000g、3～7℃下离心15～25min。进一步的，在较佳的实施例中，脂质颗粒的粒径为100nm～10μm，或者为500nm～8μm，或者为1μm～8μm，或者为3～6μm。进一步的，在一些实施例中，脂质颗粒的表面修饰有胆固醇或类固醇衍生物、C6～C24脂肪酸或其酯、壳聚糖、肽、抗体、半抗体、纳米抗体、以及适配体中的至少一种。脂质颗粒经表面修饰后可增强其与细胞微囊泡之间的亲和作用力。其中，用胆固醇或类固醇衍生物、C6～C24(或者C10～C20、或者C13～C16)的脂肪酸或其酯修饰脂质颗粒，可增强其与细胞微囊泡之间的亲脂作用；用壳聚糖修饰脂质颗粒，可增强其与细胞微囊泡之间的静电作用；用肽、抗体、半抗体、纳米抗体以及适配体修饰脂质颗粒，可增强其与细胞微囊泡之间的分子间特异性识别能力，可用于分离某一类表面具有生物标志物的细胞微囊泡。进一步的，在本专利技术的另一些实施例中，脂质颗粒的表面具有两亲性外壳，该两亲性外壳是通过用两亲性脂类化合物修饰脂质颗粒形成。其中，优选的，两亲性脂类化合物包括以下至少一种：(a)C6～C24、或者C10～C20、或者C13～C16的磷脂或糖脂；(b)胆固醇或类固醇衍生物；(c)甘油酯。进一步的，脂质颗粒为能与所述细胞微囊泡结合的脂质体、固体脂质颗粒、脂复合物颗粒或其组合。这类脂质颗粒可参照本领域中的常规方法来进行合成，例如液相沉淀法、水热反应法、微乳液法、溶胶凝胶法、微波法、超声法等。这类脂质颗粒的表面具有亲脂性基团、正电荷或者能够与细胞微囊泡进行特异性结合的生物大分子，其能够通过亲和作用与细胞微囊泡形成较强的作用力，进而在孵育过程中，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。进一步的，表面具有两亲性外壳的脂质颗粒可以为以下几种形式：A.脂质颗粒是由两亲性脂类化合物形成的单层或多层囊泡结构的脂质体；B.脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其特征在于，其包括：将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡‑脂质颗粒的复合物或融合物；再将所述细胞微囊泡‑脂质颗粒的复合物或融合物从所述生物样品中分离。

【技术特征摘要】
1.一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其特征在于，其包括：将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物；再将所述细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从所述生物样品中分离。2.根据权利要求1所述的生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其特征在于，所述生物样品与所述脂质颗粒在混合孵育时的温度为4～37℃、孵育时间为10min～24h。3.根据权利要求1所述的生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其特征在于，将所述细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从所述生物样品中分离时，采用膜过滤法、分子排阻法或离心法。4.根据权利要求1所述的生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其特征在于，将所述细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从所述生物样品中分离时，采用孔径为100nm～2μm的滤膜进行过滤。5.根据权利要求1所述的生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其特征在于，所述脂质颗粒为能与所述细胞微囊泡结合的脂质体、固体脂质颗粒、脂复合物颗粒或其组合。6.根据权利要求5所述的生物样品中细胞微囊泡的分离方...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明，范松，李劲松，
申请(专利权)人：马英淙，周明，李劲松，范松，
类型：发明
国别省市：北京,11