预刺激干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种预刺激干细胞及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于培养干细胞。本发明专利技术所述制备方法可获取受焦亡细胞分泌物预刺激的干细胞，该干细胞能够适应天然的炎症环境，提高干细胞对受损区域的修复能力，是组织工程领域种子材料预处理的新突破，同时所述预刺激干细胞也为解决临床疾病治疗提供可行方案。

Pre stimulation of stem cells and its preparation and Application

The invention relates to a pre-stimulated stem cell and its preparation method and application. The preparation method comprises the following steps: selecting the cells of non-target stem cells as auxiliary cells, inducing auxiliary cells to burn out, obtaining the secretion of dead cells, and/or the extract of dead cells for culturing stem cells. The preparation method of the invention can obtain stem cells preconditioned by the secretion of burned cells. The stem cells can adapt to natural inflammation environment, improve the repair ability of stem cells to damaged areas, and is a new breakthrough in seed material pretreatment in the field of tissue engineering. At the same time, the preconditioned stem cells can also treat clinical diseases. Provide feasible solutions.

【技术实现步骤摘要】
预刺激干细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于组织工程领域，特别涉及一种预刺激干细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
干细胞作为一种具有自我复制能力及分化潜能的细胞，可以通过增殖分化及外分泌功能对损伤区域进行修复，一直被认为是组织工程种子细胞的良好选择。病损部位包含大量坏死细胞，缺血缺氧，并伴有大量炎症细胞浸润。将干细胞植入病灶后，由于其所处环境恶劣，大部分干细胞凋亡，使干细胞的治疗效果大打折扣。为增强移植干细胞对炎症环境的适应，研究者提出在移植前对干细胞进行预刺激的方法。与直接应用干细胞相比，经过预刺激的干细胞主要优势在于：①模拟干细胞在移植体内所处环境，在预刺激过程中主动淘汰一部分适应能力差的干细胞，提高干细胞的体内移植存活率；②预刺激后干细胞从静止期或低活性期进入高活性期，增殖、分化及外分泌功能加强，使移植的干细胞对体内恶劣的环境更具有适应性。现有的干细胞预刺激方法包括①低氧刺激；②炎症因子刺激；③药物刺激；④物理刺激。不同的刺激方法对于干细胞的应激状态产生不同的影响。①低氧刺激是指体外在长期低氧的环境培养干细胞，使干细胞适应体内缺氧环境。然而，体外培养难以长期维持低氧的培养环境，频繁的低氧/复氧过程对细胞损失巨大。②炎症因子刺激是指在干细胞体外培养过程中加入炎症因子如TNF-α、白介素，使干细胞适宜体内坏损组织中的炎症浸润环境。其缺点主要在于添加的炎症因子种类、浓度的控制不当，干细胞存活率低。③药物刺激主要包括基质细胞来源因子(SDF)、干扰素(IFN)这类对细胞活性有关的药物的刺激。这类药物刺激可以使干细胞活化，增殖和分泌功能增强，但过度活化容易导致干细胞体外分化，并且药物刺激并非模拟体内真实环境，干细胞移植后存活率依然不高。④物理刺激是指通过物理刺激如电刺激、光线刺激、声波刺激、热刺激、力学刺激对细胞产生影响。这种刺激通过非接触性影响，较为容易地得到活化后的细胞，但此法给予的刺激无法模拟体内的损伤环境，细胞对此作出的响应未必对损伤环境有利。以上预刺激的共同特点在于，给干细胞施加人为的作用因素，使干细胞在受到刺激后从静止期转入相对活跃期，增强细胞活动，增强其增殖、分泌、迁移能力，提高移植存活率，以达到更优的治疗效果。但受损组织周围的微环境相当复杂，目前这些处理方法均未能对其实现真实的还原。因此，寻找一种充分模拟体内干细胞刺激环境的条件对移植干细胞具有重要意义。细胞焦亡(pyroptosis)是一种炎症性细胞坏死，主要发生原因例如是受到一系列微生物感染(如沙门氏菌，弗朗西斯氏菌)和非感染性刺激(包括心肌梗死期间产生的宿主因子)。细胞发生焦亡时，细胞核浓缩，染色质断裂，形成数量众多的焦亡小体；同时，细胞膜上形成1-2nm的小孔，破坏细胞膜的完整性，释放出包含炎性物质如IL-1β和IL-18的细胞内容物。这些细胞内容物的释放，激活及招募其他免疫细胞，诱导炎症因子、趋化因子、黏附因子等的合成，有利于机体迅速对损伤作出反应。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新的预刺激干细胞的制备方法，该制备方法通过诱导细胞焦亡再将其用于预刺激干细胞，可实现对体内损伤环境的最优模拟，使预刺激后的干细胞提高对该微环境的适应能力，增强其治疗效果。上述目的通过下述技术方案实现：一种预刺激干细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物；(2)将焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养；(3)获取具有应激状态的预刺激干细胞。在其中一个实施例中，所述辅助细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、心肌细胞、全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的任何一种或一种以上。在其中一个实施例中，所述将焦亡细胞的分泌物用于目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后收集其培养上清液，与干细胞培养液混合后用于目的干细胞的培养，和/或诱导辅助细胞焦亡后从其分泌物中提取焦亡小体，将提取所得的焦亡小体用于目的干细胞培养中。在其中一个实施例中，所述将焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养包括：通过酶消化法、裂解法、物理破碎法中的一种或一种以上获得焦亡细胞提取物，并用于目的干细胞的培养。在其中一个实施例中，所述将焦亡细胞用于目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后将诱导焦亡因素撤去，在原有体系中加入目的干细胞共培养。在其中一个实施例中，所述的诱导细胞焦亡的方法为物理方法、化学方法、生物方法。在其中一个实施例中，所述的诱导细胞焦亡的物理方法包含以紫外线、超声、微波、辐照、力学刺激中的任何一种或一种以上进行诱导；所述的诱导细胞焦亡的化学方法包含以细胞穿孔素、细胞外ATP、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白、脂多糖中的任何一种或一种以上进行诱导；所述的诱导细胞焦亡的生物方法包含以假单胞菌、沙门氏杆菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、耐药性金黄色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒、免疫缺陷类病毒中的任何一种或一种以上上述微生物及/或其培养提取物进行感染。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的预刺激干细胞。本专利技术的再一目的在于上述预刺激干细胞在组织工程产品中的应用。本专利技术所述预刺激干细胞的制备方法，相对于现有技术具有以下的优点和效果：(1)预刺激环境与天然炎症环境相似度高：焦亡细胞分泌物含有的炎性物质，其成分和数量都与天然炎症环境相类似，更好地模拟了损伤部位所处的炎症环境；(2)所得干细胞体内移植适应性良好：通过焦亡细胞分泌物使干细胞提前适应体内恶劣环境，使干细胞及时作出相应的变化，提高干细胞的移植存活率和治疗效果；(3)所得干细胞分泌功能加强：为了适应环境的改变，在焦亡细胞分泌物的刺激下培养的干细胞可增强其分泌功能，分泌更多有利于细胞生长的因子；(4)可选择性保留生长状态良好的细胞：在焦亡细胞分泌物预刺激后，有一部分生长状态较差的细胞死亡，选择性地保留了生长状态良好的细胞，为进一步的细胞治疗提供更优质的细胞来源；(5)处理过程无毒无害：本方法采用细胞分泌物或细胞作为刺激源，避免了化学物质，物理因素或病菌与目的干细胞的直接接触，处理条件温和，预刺激后的干细胞不会有残留的毒性物质，不会对干细胞的使用产生毒性作用；(6)可避免细胞的过度刺激：焦亡细胞分泌物给干细胞带来的刺激程度适中，避免药物带来过度刺激使细胞迅速分化、老化，存活率下降。通过本专利技术所述预刺激干细胞的制备方法，可获取受焦亡细胞分泌物等预刺激的干细胞，使得到的干细胞能够适应天然的炎症环境，提高干细胞对受损区域的修复能力。该预刺激干细胞的制备方法是组织工程领域种子材料预处理的新突破，同时所述预刺激干细胞也为解决临床疾病治疗提供可行方案。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物；(2)将焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养；(3)获取具有应激状态的预刺激干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物；(2)将焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养；(3)获取具有应激状态的预刺激干细胞。2.根据权利要求1所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述辅助细胞为单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、心肌细胞、角膜基质细胞、全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的任何一种或一种以上。3.根据权利要求1所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述将焦亡细胞的分泌物用于目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后收集其培养上清液，与目的干细胞培养液混合后用于目的干细胞的培养,和/或诱导辅助细胞焦亡后从其分泌物中提取焦亡小体，将提取所得的焦亡小体用于目的干细胞培养中。4.根据权利要求1所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述将焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养包括：通过酶消化法、裂解法、物理破碎法中的一种或一种以上获得焦亡细胞提取物，并用于目的干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：武征，陈宝欣，樊泽培，陈剑，赵巨鹏，张建华，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44