重组多肽的制造方法技术

本发明专利技术提供可使用动物培养细胞以高生产量制造蛋白质的方法，其包括培养表达APES(抗体产生增强序列)，并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，产生希望得到的多肽。APES含与NfkBia关联的碱基序列，有降低细胞内的NfkBia的表达的功能。

Manufacturing method of recombinant polypeptide

The present invention provides a method for producing proteins with high yield using animal cultured cells, including culturing cells expressing APES (antibody-producing enhancement sequences) and introducing DNA encoding desired peptides to produce desired peptides. APES contains the nucleotide sequence associated with NfkBia, which has the function of reducing the expression of NfkBia in cells.

【技术实现步骤摘要】
重组多肽的制造方法本申请是申请日为2012年3月30日、专利技术名称为“重组多肽的制造方法”的中国专利申请No.201280015594.2的分案申请。
本专利技术涉及重组多肽的制造方法，更具体而言，使用核因子κB抑制物α(NfkBia)的表达降低的动物细胞有效制造多肽的方法。
技术介绍
使用基因重组技术，生产作为医药有用的蛋白质之时，使用动物细胞，则由于原核细胞无法进行的复杂的翻译后修饰或折叠变得可能，动物细胞多用作用于重组蛋白质生产的宿主细胞。近年、抗体或生理活性蛋白质等的多种生物药品辈出，在动物细胞中有效生产重组蛋白质的技术关系到生物药品的低成本化，从而约束向患者的稳定的供给。从而，期望生产效率更高的蛋白质的制造方法。NfkBia(IKBα、核因子κB抑制物α)是B-细胞抑制物中κ多肽基因增强子的核因子，α的简称，与作为涉及细胞内的信号传递的转录因子的NF-κB的活化相关。NfkBia是NF-κB的失活因子之一。新生物合成的NfkBia通过在核内诱导表达，负调节NF-κB的DNA结合和转录活性(非专利文献1)。另外，如NfkBia一样抑制细胞增殖的一部分的基因表达在几乎全部的小鼠或人肿瘤细胞中被抑制(非专利文献2)。NF-κB通常与如NfkBia一样的失活因子结合着存在，但由各种刺激从失活因子游离活化，迁移到核内，与在细胞因子、生长因子、粘接分子、细胞死亡控制因子其他各种各样的目标基因的启动子/增强子区域的特异性DNA序列(5’-GGGACTTTCC-3’、称为NFκB结合序列、kB基序、NFkB应答元件等(SEQIDNO:35))结合，与转录活性的调节相关(非专利文献3)。另一方面，作为在动物培养细胞内的NfkBia的行为，不知与重组蛋白质的产生能力的关系。【现有技术文献】【非专利文献】非专利文献1:InduciblenuclearexpressionofnewlysynthesizedIkappaBalphanegativelyregulatesDNA-bindingandtranscriptionalactivitiesofNF-kappaBMol.Cell.Biol.,051995,2689-2696,Vol15,No.5非专利文献2:Frommicetohumans:IdentificationofcommonlyderegulatedgenesinmammarycancerviacomparativeSAGEstudiesHuY.,SunH.,DrakeJ.,KittrellF.,AbbaM.C.,DengL.,GaddisS.,SahinA.,BaggerlyK.,MedinaD.andAldazC.M.CancerResearch200464:21(7748-7755)非专利文献3:"NewinsightsintotheRoleofNuclearFactor-kappaBinCellGrowthRegulation"AmericanJournalofPathology,2001,Vol.159,No.2:387-397
技术实现思路
【专利技术要解决的技术课题】本专利技术旨在提供能以高的生产量制造天然型蛋白质或重组蛋白质的方法。【解决课题的技术方案】本专利技术人为了解决上述课题进行锐意努力，以有高的产生重组抗体的能力的培养细胞株(CHO细胞株)作为材料，对于在所述细胞株中表达显著的基因进行检查的结果，鉴定一种mRNA型非编码RNA，其通过使用特定的小鼠序列作为探针而被识别。此转录产物相当于NfkBia的mRNA的非翻译区域的互补链。又发现，通过在重组培养细胞中表达由此转录产物中的一部分的序列组成的核酸分子，显著地升高所述培养细胞的重组多肽的产生能力。另外，本专利技术人发现，在所述非编码RNA的表达上调的高产生抗体的细胞中NfkBia的表达被抑制。再者，本专利技术人发现，有高的重组抗体产生能力的培养细胞在细胞内NfkBia的表达被抑制。从而认为，通过高表达控制培养细胞内的NfkBia的表达的转录产物，可增加希望得到的多肽的生产量，从而完成本专利技术。在本说明书中，将这样的通过在培养细胞内表达量增加，有升高重组抗体等的蛋白质的产生能力的功能的RNA或DNA或它们的序列总称而命名为APES(抗体产生增强序列)(根据情况，称为PPES(多肽产生增强序列))。本专利技术人推定，APES(或者PPES)通过控制培养细胞内的NfkBia的表达，增强Nf-κB的活性，由此升高重组多肽产生能力。推定活性增强的NF-κB迁移到核内，使免疫、炎症、抗凋亡关联基因(Bcl-2,Bcl-xL，IAPs(凋亡蛋白抑制物)等)的表达亢进，恭献于细胞的增殖或生存率维持等。还有，在通常的抗体等的重组蛋白质或肽的表达基因的用质粒的启动子/增强子区域存在多个的NF-κB结合序列推定，迁移到核内的NF-κB增强表达质粒的启动子活性，恭献于进一步的抗体的高产生化。这样的序列是，例如，在MCMV启动子的情况，小鼠巨细胞病毒来源序列(DD434486)中存在8个位置、人巨细胞病毒来源序列(DI097553)中存在3个位置的NF-κB结合序列。本专利技术的要旨如下。(1)多肽的制造方法，其包括培养表达APES、并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，以及产生希望得到的多肽。(1-1)(1)的方法，其中细胞是强表达APES的细胞。(2)(1)的方法，其中APES是含通过碱基对形成结合于人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的NfkBia的基因的DNA或mRNA，可抑制NfkBia的基因的表达的碱基序列的核酸分子。(3)(2)的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至30碱基长的低分子RNA。(4-1)(2)的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至561碱基长的mRNA型非编码RNA。(4)(2)的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至500碱基长的mRNA型非编码RNA。(5-1)(2)的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的561～1579碱基长的mRNA型非编码RNA。(5)(2)的方法，其中APES是含可通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的500～1000碱基长的mRNA型非编码RNA。(6)(3)～(5)之任一项的方法，其中19～25碱基长的连续的序列是SEQIDNO:2所示的碱基序列中任一个的部分序列。(7-1)(6)的方法，其中APES选自含以下的碱基序列的核酸分子：(a)由SEQIDNO:1～16及29之任一个的碱基序列组成的DNA；(b)含上述(a)的序列，是NfkBia基因的3’侧非翻译区域的部分序列的DNA；(c)由与上述(a)或(b)的序列除1个或数个碱基外相同的碱基序列组成的DNA；(d)是上述(a)、(b)或(c)的转录产物的RNA；(e)由可通过碱基对形成结合于上述(a)的序列的序列组成的DNA或RNA。(7)(6)的方法，其中APES选自含以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多肽的制造方法，其包括培养表达APES、并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，以及产生希望得到的多肽。

【技术特征摘要】
2011.04.01 JP 2011-0820021.多肽的制造方法，其包括培养表达APES、并且导入编码希望得到的多肽的DNA的细胞，以及产生希望得到的多肽。2.权利要求1的方法，其中APES是含通过碱基对形成结合于人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的NfkBia的基因的DNA或mRNA，能抑制NfkBia的基因的表达的碱基序列的核酸分子。3.权利要求2的方法，其中APES是含能通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至30碱基长的低分子RNA。4.权利要求2的方法，其中APES是含能通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的至561碱基长的mRNA型非编码RNA。5.权利要求2的方法，其中APES是含能通过碱基对形成结合于NfkBia的mRNA之一部分的19～25碱基长的序列的561～1579碱基长的mRNA型非编码RNA。6.权利要求3～5之任一项的方法，其中19～25碱基长的连续的序列是SEQIDNO:2所示的碱基序列中任一个的部分序列。7.权利要求6的方法，其中APES选自含以下的碱基序列的核酸分子：(a)由SEQIDNO:1～16及29之任一个的碱基序列组成的DNA；(b)含上述(a)的序列，是NfkBia基因的3’侧非翻译区域的部分序列的DNA；(c)由与上述(a)或(b)的序列除1个或数个碱基外相同的碱基序列组成的DNA；(d)是上述(a)、(b)或(c)的转录产物的RNA；及(e)由能通过碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：田渊久大，杉山朋也，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP