一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法技术

本发明专利技术公开了一个基于聚合酶链式反应的计数血液或淋巴液样品中的循环肿瘤细胞的方法。本发明专利技术使用的细胞样品可以是经过循环肿瘤细胞富集或是不经过富集的。本发明专利技术首先将细胞样品分成许多组分，使得每个组分实际上含有不超过一个循环肿瘤细胞，从每个组分的细胞中提取RNA和DNA，并使用逆转录酶将RNA转录物逆转录为cDNA，然后用PCR方法检测每个组分中的肿瘤特异性序列的存在，并以含有肿瘤特异性序列的组分数量作为样品中循环肿瘤细胞的数量。

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年3月5日提交的美国临时专利申请第62/467,181号和于2018年2月25日提交的美国专利申请15/904,393号的权益，所述美国专利申请的内容以参考的方式并入本文中。
本专利技术涉及分子肿瘤学领域的方法和技术，尤其涉及使用高灵敏聚合酶链式反应来检测和计数血液和淋巴样品中的循环肿瘤细胞的方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞是从原发性和转移性肿瘤组织流入血液中的肿瘤细胞。与侵袭性肿瘤组织活检相比，循环肿瘤细胞可以作为非侵入性、易于获得的“实时液体活检”，并且可用于实时监测肿瘤进展，因此，循环肿瘤细胞的分离和分析对于侵袭性癌症的早期检测，癌症治疗的预后预测，耐药性的检测以及晚期癌症的管理都具有很好的前景。尽管循环肿瘤细胞分析在临床应用中具有很大的潜力，但血液样品中循环肿瘤细胞的稀有度(例如每毫升只有1-10个)和循环肿瘤细胞群体的异质性对于循环肿瘤细胞的检测和分析构成了巨大的技术挑战。1ml血液样品中只有1-10个循环肿瘤细胞，却含有约8×109个红细胞和5×106个白细胞，因此，在血液中寻找循环肿瘤细胞就像大海捞针一样困难，更糟糕的是，循环肿瘤细胞的异质性使得很难找到通用的遗传学或细胞学标记用来富集和检测循环肿瘤细胞。用于富集循环肿瘤细胞的最常用标记是叫做上皮细胞粘附分子(EpCam)的一种细胞表面蛋白，它在上皮来源的循环肿瘤细胞中表达，使用基于EpCam的免疫磁珠方法来富集循环肿瘤细胞将导致不表达或低水平表达EpCam的循环肿瘤细胞的丢失，为了避免这个问题，人们使用针对不同肿瘤特异性抗原的多种抗体来选择循环肿瘤细胞。另一种选择循环肿瘤细胞的方法是基于不同细胞类型之间的大小差异，因为肿瘤细胞通常比白细胞和红细胞的尺寸更大，然而，由于不同类型的肿瘤细胞的大小不同，小的肿瘤细胞可能与白血细胞差不多大小，因此，这种基于细胞大小差异的分离方法会导致小肿瘤细胞的丢失。浓缩过程中循环肿瘤细胞的丢失是造成循环肿瘤细胞检测和计数不准确的一个重要因素。目前的循环肿瘤细胞检测方法可以分为两种主要类型：基于核酸的方法和基于细胞计数的方法。基于核酸的检测方法使用聚合酶链式反应(PCR)来检测肿瘤细胞中特异性表达的DNA或RNA序列。通过使用多种肿瘤特异性标记物，这种基于PCR的方法可以有很高的灵敏度，它可以在不富集循环肿瘤细胞的情况下进行，但相应会降低灵敏度。该方法检测从裂解细胞制备的核酸，因此不能观察细胞形状及进行细胞计数。这类方法的另一个缺点是很难使不同实验室的技术标准化，因此很难在临床环境中可靠地使用。基于细胞计数的检测方法使用免疫组织化学和免疫荧光来显现细胞形状并计数循环肿瘤细胞。这类方法首先对来自血液样品的细胞进行预处理以富集肿瘤细胞，然后通过用抗体染色使富集的细胞可视化，染色抗体一般包括针对多种肿瘤特异性标记物的抗体和一种针对白细胞特异性标记物的抗体，肿瘤细胞具有至少一种肿瘤特异性标记物显示阳性同时白细胞特异性标志物显示为阴性，这种方法在检测循环肿瘤细胞时具有很高的特异性。但是，这种方法取决于肿瘤细胞中肿瘤特异性标记物的表达水平和所用抗体的特异性，由于没有标记物对肿瘤细胞是纯粹特异的，并且标记物表达水平在不同的肿瘤细胞中有所不同，所以可能导致假阳性和假阴性检测的结果。该方法的灵敏度很大程度上取决于抗体对肿瘤特异性标记物的特异性和结合强度，与基于核酸的方法相比较，这种方法通常有更高的特异性，但更低的灵敏度。因此，迫切需要开发具有高灵敏度和高特异性的循环肿瘤细胞检测技术，并且这种技术在不同实验室之间使用可以产生可比较的结果，好的检测方法还应是可以应用于所需处理较少或甚至未富集的血液样品以使循环肿瘤细胞损失最小化。本专利技术具备了这样的优点，并且还提供了其他益处。专利技术概述目前基于PCR的循环肿瘤细胞检测方法提供了一种灵敏的方法来检测逃逸到循环血液或淋巴中的肿瘤细胞。现有的基于PCR的检测方法的一个缺点是它需要在进行PCR分析之前裂解细胞，以致无法对循环肿瘤细胞进行计数。本专利技术提供了一种基于PCR的用于循环肿瘤细胞计数的方法，它的特点是在核酸提取和PCR分析之前首先将细胞样品划分成许多组分，将含有循环肿瘤细胞的样品分级至使得超过50％的组分中每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞的程度。许多组分不包含任何循环肿瘤细胞，对于含有循环肿瘤细胞的组分，其中大多数组分只包含一个,然后从每个组分的细胞中提取DNA和RNA，最后进行PCR扩增来识别出具有表达高于背景水平的肿瘤特异性基因的细胞的组分,这样的细胞被鉴定为循环肿瘤细胞。本专利技术提供了一种对样品中的循环肿瘤细胞进行计数的方法，包括以下步骤：a)将样品平均分级成多个的组分，其中超过50％的组分每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞；b)从每个组分的细胞中提取RNA和/或DNA，并从提取的RNA逆转录产生cDNA；c)在各组分中使用至少一对肿瘤特异性引物用于扩增肿瘤特异性序列；d)检测每个组分中扩增的肿瘤特异性序列；和e)对扩增的肿瘤特异性序列的组分进行计数，以确定样品中循环肿瘤细胞的数量。在一些实施例中，每个组分包含不多于一个循环肿瘤细胞。本方法可用于从任何怀疑含有肿瘤细胞的细胞样品(例如患者的血液样品和患者的淋巴液样品)中检测循环肿瘤细胞。通过去除非肿瘤细胞(例如红血细胞和白血细胞)，样品可以富集循环肿瘤细胞，或者也可以使用不富集循环肿瘤细胞的样品。可以对细胞样品进行预处理以解离细胞团，确保细胞在样品中分离成单个细胞。样品被分成许多同体积的组分，直到没有单个组分可能含有多于一个循环肿瘤细胞。每个组分含有不超过一个循环肿瘤细胞，但可能含有许多非肿瘤细胞(例如白细胞)。例如，样品可以分成多于10、100、1000、10,000和100,000个组分。将细胞分成许多组分的方法有很多，例如，直接将它们添加到多孔PCR板中，使用微流控芯片(例如数字PCR芯片)将它们分配到成千上万个隔室中，或者使用液滴将它们封装到成千上万个微液滴中。在一些实施方案中，本方法通过除去非肿瘤细胞如红细胞，白血细胞和淋巴细胞，来富集样品中的循环肿瘤细胞。根据肿瘤细胞和血液细胞之间的大小差异可以富集循环肿瘤细胞。具体来说，体积大的循环肿瘤细胞被选择并富集，同时体积小的白细胞被去除。另外一种富集循环肿瘤细胞的方法，可以通过选择与特异性细胞表面抗原(如EpCam)的抗体相结合的细胞。富集后的样品可以被稀释到这样的程度，使得每个组分包含不超过一个单个细胞。在这种情况下，一个组分可能不包含任何细胞，含有一个循环肿瘤细胞，或是含有一个非肿瘤细胞。将循环肿瘤细胞和非肿瘤细胞进行肿瘤基因表达的进行一对一的比较，这样能够检测到基因表达的较小差异。找到的单个循环肿瘤细胞可被提取出来，并用于进一步的基因型和表达谱的分析。选择正确的肿瘤特异性标记基因对于成功检测和鉴定样品中的循环肿瘤细胞是很关键的。如果样品是从已知癌症类型的患者收集的，则肿瘤特异性基因可被选择为该癌症特异性的癌症基因。最好选择仅在癌细胞中表达，而不在正常血液细胞中表达的癌基因。使用这些仅在癌细胞中表达的标记基因，即使在最低限度处理的或未富集的细胞样品中，也能够非常灵敏的从成千上万个非肿瘤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法，包括以下步骤：a) 把细胞样品平均分级成众多的组分，其中超过50%的组分每个组分包含不超过一个循环肿瘤细胞；b) 从每个组分的细胞中提取核糖核酸并逆转录成cDNA, 和/或提取脱氧核糖核酸；c) 使用至少一对肿瘤细胞特异性引物用聚合酶链式反应来扩增肿瘤特异性序列；d) 检测每个组分中扩增的肿瘤特异性序列；并且e) 通过计数含有肿瘤特异性序列的组分的数量来决定样品中循环肿瘤细胞的数目。

【技术特征摘要】
2017.03.05 US 62/467181;2018.02.25 US 15/9043931.一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法，包括以下步骤：a)把细胞样品平均分级成众多的组分，其中超过50%的组分每个组分包含不超过一个循环肿瘤细胞；b)从每个组分的细胞中提取核糖核酸并逆转录成cDNA,和/或提取脱氧核糖核酸；c)使用至少一对肿瘤细胞特异性引物用聚合酶链式反应来扩增肿瘤特异性序列；d)检测每个组分中扩增的肿瘤特异性序列；并且e)通过计数含有肿瘤特异性序列的组分的数量来决定样品中循环肿瘤细胞的数目。2.根据权利要求1所述的方法，其中每个组分包含不超过一个循环肿瘤细胞。3.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞样品经过或者不经过富集循环肿瘤细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中超过50%的组分每个组分包含不超过一个细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其中细胞样品是血液或淋巴液样品。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品去除了红细胞和白细胞。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性序列是核糖核酸转录物，该转录物在肿瘤细胞中比正常血液细胞或淋巴细胞有更高的表达水平，最好在正常血液细胞或淋巴细胞中检测不到。8.根据权利要求1所述的方法，其中肿瘤特异性引物设计成扩增在一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：王焱，
申请(专利权)人：南京科维思生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32