一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种Cas9/RNP制备PD‑1和LAG3双基因敲除CD19 CAR‑T细胞的方法，包括将用于敲除PD‑1和LAG3基因的sgRNA及Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+细胞中进行电穿孔转化；采用CD19 CAR慢病毒转染CD4+/CD8+阳性细胞；以及筛选并培养扩增转染后的T细胞已获得PD‑1和LAG3双基因敲除CD19CAR‑T细胞。本发明专利技术选用Cas9/RNP基因编辑系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化了CAR‑T细胞的制备流程，增加了系统的可行性和负载量。另外，本发明专利技术敲除PD‑1和LAG3双基因时避免使用转染试剂，安全性更高。

【技术实现步骤摘要】
一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法
本专利技术涉及免疫细胞制备领域，具体地，本专利技术涉及一种利用Cas9/RNP制备PD-1和LAG3敲除的CD19CAR-T细胞。
技术介绍
继手术、放疗、化疗后，肿瘤的免疫疗法已成为行之有效的治疗方式，近期收到广泛关注。其中嵌合抗原受体T细胞技术(CheimericAntigenReceptors-Tcell,CAR-T)是一种新出现的过继性细胞疗法(Adoptivecelltransfertherapy,ACT)，该技术将患者T细胞在体外修饰、活化和增殖后回输到患者体内，通过T细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，并显示较强的杀伤活性和持久性。死亡分子-1(Programmeddeath-1,PD-1,也称为CD279)属于T淋巴细胞的抑制性共受体，是一种重要的免疫检查点，其配体(Programmeddeathligand1,PD-L1,也称为B7-H1或CD274)可在多种肿瘤细胞表面表达。PD-1/PD-L1结合介导负性免疫调节通路，有利于形成肿瘤微环境，促进肿瘤免疫逃逸。淋巴细胞活化基因-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备PD‑1和LAG3敲除CD19 CAR‑T细胞的方法，包括以下步骤：准备CD4+/CD8+ T细胞；准备与用于敲除PD‑1和LAG3基因的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白；将准备的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+ T细胞中进行电转化；准备CD19嵌合抗原受体慢病毒；将准备的慢病毒用于感染电转化后的CD4+/CD8+ T细胞，antiCD3+CD28抗体激活T细胞扩增培养，通过荧光筛选实验以获得PD‑1和LAG3敲除的CD19 CAR‑T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备PD-1和LAG3敲除CD19CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：准备CD4+/CD8+T细胞；准备与用于敲除PD-1和LAG3基因的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白；将准备的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+T细胞中进行电转化；准备CD19嵌合抗原受体慢病毒；将准备的慢病毒用于感染电转化后的CD4+/CD8+T细胞，antiCD3+CD28抗体激活T细胞扩增培养，通过荧光筛选实验以获得PD-1和LAG3敲除的CD19CAR-T细胞。2.如权利要求1所述方法，其中CD4+/CD8+T细胞的获得是通过EasySeq试剂盒按说明书操作，制备而成。3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除PD-1和LAG3的sgRNA由tracrRNA和crRNA两部分组成，其中PD-1的crRNA靶向序列如SEQIDNo.1～2所示，LAG3的crRNA靶向序列如SEQNo.3～4所示。4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除PD-1和LAG3的Cas9蛋白为体外蛋白，羧基端有一个HA标签和两个核定位信号序列如SEQNo.5-6。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈相波，雷鸣，田朋飞，
申请(专利权)人：杭州荣泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33