一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法技术

本发明专利技术涉及一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法，其包括以下步骤：步骤一：从乳鼠中提取原代成骨细胞，将原代成骨细胞在含10％FBS的α‑MEM培养基中培养，直至得到第三代成骨细胞；步骤二：提取pcDNA3.1(+)‑phb2质粒，pcDNA3.1(+)‑phb2为含抗增殖蛋白2片段的pcDNA3.1(+)真核表达载体；步骤三：将第三代成骨细胞在37℃下以及5％CO2的条件下孵育；当细胞汇合度≥90％时，用脂质体将pcDNA3.1(+)‑phb2质粒进行瞬时转染；步骤四：转染后，除去旧的培养基，加入新鲜的无抗生素的含10％FBS的α‑MEM培养基，继续培养。本发明专利技术提供的转染方法能够有效地将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中，对绝经后骨质疏松症治疗方法和药物的研究有重要意义。

A method for transfection of anti proliferative protein 2 into osteoblasts

The invention relates to a method for transfecting antiproliferative protein 2 into osteoblasts, which comprises the following steps: first, extracting primary osteoblasts from suckling mice, culturing primary osteoblasts in a 10% FBS-containing alpha_MEM medium until the third generation of osteoblasts is obtained; second, extracting pcDNA3.1 (+) phb2 plasmid; PcDNA3.1 (+) phb2 is a pcDNA3.1 (+) eukaryotic expression vector containing an anti-proliferative protein 2 fragment; step 3: the third generation osteoblasts were incubated at 37 C and 5% CO 2; when the confluence degree of cells was more than 90%, the pcDNA3.1 (+) phb2 plasmid was transfected by liposome; step 4: after transfection, the old medium was removed A fresh, antibiotic free 10%FBS containing MEM medium was further cultured. The transfection method provided by the invention can effectively transfect anti-proliferative protein 2 into osteoblasts, and has important significance for the research of treatment methods and drugs for postmenopausal osteoporosis.

【技术实现步骤摘要】
一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法。
技术介绍
绝经后骨质疏松症(PMOP)是中老年妇女常见的代谢性骨病，而且其发生率随着年龄的增大而不断的升高。随着人们生活条件的日益提升、寿命的不断延长使得老龄化口呈现出不断上升的趋势，PMOP已日益突出地成为社会关注和人类健康问题。绝经后成骨细胞的异常凋亡是引起骨质疏松的又一重要机制。线粒体在细胞生命活动过程以及细胞凋亡过程中承担着重要角色，而线粒体内膜中含有一种膜蛋白叫抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)，该蛋白能够维持线粒体的结构和功能，并且在细胞的分化和凋亡活动中有着重要的地位。成骨细胞和骨细胞中存在PI3K/Akt信号通路，该信号通路与成骨细胞增殖、分化和凋亡的活动有关。Akt包括了Akt1、Akt2、Akt3三种亚型，其中Akt1和Akt2对骨代谢有重要作用，且Akt2是成骨细胞增殖分化所必需的，激活PI3K/Akt信号通路可增加成骨细胞的分化。PHB与PI3K/Akt信号通路相关，而药物或因子也可以引起成骨细胞中PHB表达的变化。PHB是由抗增殖蛋白1(prohibitin1，PHB1)和抗增殖蛋白2(prohibitin2，PHB2)两个亚型所构成的，两个亚型互为同聚体，而PHB2在哺乳动物细胞中是雌激素受体转录活动的抑制因子，并且在细菌、植物、哺乳动物等高度保守。已有很多文献报道了PHB2可以抑制多种不同转录因子的转录活动，其中就包括了ERα、Akt、E2F1等转录因子。我们在过往的成骨细胞蛋白质组学研究中发现，黄芪三仙汤能引起PMOP大鼠成骨细胞PHB明显的差异表达，并且经Westernblot试验得到证明(参见GuoCC，ZhengLH，FuJY，etal.AntiosteoporoticeffectsofHuangqiSanxiandecoctioninculturedratosteoblastsbyproteomiccharacterizationofthetargetandmechanism[J].Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine，2015)。我们推测抗增殖蛋白是黄芪三仙汤的关键的作用靶点，而其亚型PHB2可能通过PI3K/Akt2信号通路以及ERα、MyoD、MEF2等转录因子来调节成骨细胞分化、凋亡以及调控雌激素受体水平，从而达到防治PMOP的作用。因此，基于上述的理论与既往的研究成果，需要寻找一种将PHB2转染到成骨细胞中的方法，可用于进一步研究PHB2在成骨细胞中的作用机制，为防治PMOP提供新的作用靶点和途径，促进相关治疗方法和药物的研发进程。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的主要目的是提供一种将PHB2有效地转染到成骨细胞中的方法。为解决上述主要技术问题，本专利技术提供了一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法，该包括以下步骤：步骤一：从乳鼠中提取原代成骨细胞，将原代成骨细胞在含10％FBS的α-MEM培养基中培养，直至得到第三代成骨细胞；步骤二：提取pcDNA3.1(+)-phb2质粒，pcDNA3.1(+)-phb2为含抗增殖蛋白2片段的pcDNA3.1(+)真核表达载体；步骤三：将第三代成骨细胞在37℃下以及5％CO2的条件下孵育；当细胞汇合度≥90％时，用脂质体将质粒进行瞬时转染；步骤四：转染后，除去旧的培养基，加入新鲜的无抗生素的含10％FBS的α-MEM培养基，继续培养。进一步的技术方案是，步骤一中，乳鼠为1至3日龄的Sprague-Dawley大鼠。进一步的技术方案是，步骤二中，使用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取pcDNA3.1(+)-phb2质粒。进一步的技术方案是，步骤三中，脂质体为Lipofectamine3000。进一步的技术方案是，步骤三中，转染条件为：Lipofectamine3000与质粒的体积质量比为15μl：5μg。进一步的技术方案是，步骤三中，孵育包括将所述第三代成骨细胞以每孔30万接种到6孔板中进行孵育。进一步的技术方案是：步骤四中，除去旧的培养基在转染后6小时进行。进一步的技术方案是：步骤四中，继续培养的时间为48小时。本专利技术能够取得以下有益效果：(1)通过本专利技术的转染方法，能够有效制备得到将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞，可用于进一步研究作用机制，为防治PMOP的方法和药物提供条件。(2)本专利技术的转染方法具有工艺简单、反应条件温和、安全环保的优点，并且本专利技术的转染方法具有良好的转染效果。附图说明以下结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1(a)是成骨细胞的低倍(10X)倒置荧光显微镜图。图1(b)是成骨细胞的高倍(20X)倒置荧光显微镜图。图2(a)是pcDNA3.1(+)-EGFP的构建示意图。图2(b)是pcDNA3.1(+)-phb2的构建示意图。图3是NC组和过表达组的PHB2mRNA相对表达水平图。具体实施方式实施例：本实施例的将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法包括以下步骤：步骤一：原代成骨细胞从1至3日龄的Sprague-Dawley大鼠提取；所提取的原代成骨细胞在含10％FBS的α-MEM培养基中培养，将成骨细胞培养至第三代。其中，1-3日龄的Sprague-Dawley大鼠由广州中医药大学实验动物中心所提供。步骤二：使用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP质粒和pcDNA3.1(+)-phb2质粒。其中，pcDNA3.1(+)-EGFP和pcDNA3.1(+)-phb2真核表达载体均为上海吉凯基因化学技术有限公司所构建，具体如图1所示。无内毒素质粒小提中量试剂盒由北京天根公司提供。步骤三：将第三代成骨细胞以每孔30万接种到6孔板中，在37℃下用5％CO2条件下孵育，当细胞汇合度≥90％时，分为pcDNA3.1(+)-EGFP空载组(NC组)和pcDNA3.1(+)-phb2过表达组，使用脂质体将质粒进行瞬时转染。其中脂质体为Lipofectamine3000；转染条件为15μlLipofectamine3000，5μg质粒。Lipofectamine3000由美国的Invitrogen提供。步骤四：转染后6小时，去掉旧的培养基，加入新鲜的无抗生素的含10％FBS的α-MEM培养基，培养箱内继续培养。检测：(1)成骨细胞碱性磷酸酶染色鉴定在步骤一中成骨细胞培养至第三代时，用NBT/BCIP碱性磷酸酶试剂盒进行染色鉴定成骨细胞，倒置荧光显微镜下观察。其中，NBT/BCIP碱性磷酸酶试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供，倒置荧光显微镜由日本的Nikon提供。(2)总RNA的提取和实时荧光定量PCR在步骤四的转染后成骨细胞继续培养48h后，根据TRIzol试剂盒的使用方法提取总RNA，纯度检测合格后，使用cDNA合成试剂盒推荐方法在逆转录酶反应中加1μgRNA进行逆转录。然后用无菌水将所得cDNA稀释至100μl。其中，TRIzol试剂盒由美国Invitrogen提供，cDNA合成试剂盒由美国Roche公司提供。上样，每组样本基因做3个复孔，根据实时荧光定量PCR(qRT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：从乳鼠中提取原代成骨细胞，将所述原代成骨细胞在含10％FBS的α‑MEM培养基中培养，直至得到第三代成骨细胞；步骤二：提取pcDNA3.1(+)‑phb2质粒，所述pcDNA3.1(+)‑phb2为含抗增殖蛋白2片段的pcDNA3.1(+)真核表达载体；步骤三：将第三代成骨细胞在37℃下以及5％CO2的条件下孵育；当细胞汇合度≥90％时，用脂质体将pcDNA3.1(+)‑phb2质粒进行瞬时转染；步骤四：转染后，除去旧的培养基，加入新鲜的无抗生素的含10％FBS的α‑MEM培养基，继续培养。

【技术特征摘要】
1.一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：从乳鼠中提取原代成骨细胞，将所述原代成骨细胞在含10％FBS的α-MEM培养基中培养，直至得到第三代成骨细胞；步骤二：提取pcDNA3.1(+)-phb2质粒，所述pcDNA3.1(+)-phb2为含抗增殖蛋白2片段的pcDNA3.1(+)真核表达载体；步骤三：将第三代成骨细胞在37℃下以及5％CO2的条件下孵育；当细胞汇合度≥90％时，用脂质体将pcDNA3.1(+)-phb2质粒进行瞬时转染；步骤四：转染后，除去旧的培养基，加入新鲜的无抗生素的含10％FBS的α-MEM培养基，继续培养。2.根据权利要求1所述的一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法，其特征在于：步骤一中，所述乳鼠为1至3日龄的Sprague-Dawley大鼠。3.根据权利要求1所述的一种将抗增殖蛋白2转染到成骨细胞中的方法，其特征在于：步骤二中，使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志昆，傅健英，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44