ATP硫酸化酶活性的检测方法技术

本申请公开了一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸分别和腺苷5’三磷酸、荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入ATP硫酸化酶；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的PPi，测得对应的FPPi，生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶活性参数；(8)判断ATP硫酸化酶活性。采用本发明专利技术的检测方法能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性。

Detection of ATP sulfated enzyme activity

The application discloses a method for detecting the activity of ATP sulfatase, which comprises the following steps: (1) mixing pyrophosphate of different concentrations with adenosine 5'triphosphate and fluorescein/luciferase to obtain a mixture; (2) dividing the mixture into two equal parts and adding the mixture into the test sample pool and the control sample pool respectively; (3) in the control sample pool. Then the buffer was injected and ATP sulfatase was injected into the test sample pool. (4) The fluorescence intensity produced by the reaction of ATP with fluorescein/luciferase in the test sample pool and the fluorescence intensity in the control sample pool were detected by opening the detector, and the fluorescence intensity time curve was obtained. (5) The corresponding F was measured for different PPi concentrations. PPi, producing calibration curve; (6) making Michaelis curve: (7) according to Michaelis formula, the Vmax fitted is to measure the activity of ATP sulfatase parameters; (8) judging the activity of ATP sulfatase. The detection method of the invention can detect the activity of ATP sulfated enzyme conveniently and quickly.

【技术实现步骤摘要】
ATP硫酸化酶活性的检测方法
本申请涉及一种检测方法，具体涉及ATP硫酸化酶活性的检测方法。
技术介绍
ATP硫酸化酶能够将焦磷酸(PPi)与腺苷5’三磷酸(APS)耦合并催化成三磷酸腺苷(ATP)，其活性直接影响催化速率及检测灵敏度。而PPi是生命体内重要的能量代谢分子，对其的快速实时定量检测能间接探测生命体的能量代谢过程，尤其是主要代谢路径的识别。现在还没有一种能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性的方法。
技术实现思路
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性的方法。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷5’三磷酸APS、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，则测试样品池发生酶促反应：根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷5’三磷酸APS、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，则测试样品池发生酶促反应：

【技术特征摘要】
1.一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷5’三磷酸APS、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，则测试样品池发生酶促反应：根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；其中ATPsulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k+表示ATPsulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k--表示ATPsulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；kcat表示ATPsulfurylase对PPi的催化速率；(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的PPi荧光强度FPPi，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α9：在线性区间:[ATP]＝α9FATP,[ATP]表示ATP的浓度；FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度；所述荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒咬根，罗永涛，
申请(专利权)人：易尚明天科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11