提取林木组织或器官RNA的方法和鉴定林木组织特异性miRNA的方法技术

本发明专利技术提出了一种提取林木组织或器官RNA的方法、林木特异性条形码(barcode)序列设计和鉴定林木组织特异性miRNA的方法。提取林木组织或器官RNA的方法包括：将待处理样品与交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)进行第一接触，并在液氮条件下进行研磨处理，将研磨处理后产物与Trizol、β‑巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)进行第二接触。利用该方法，避免了因植物组织中富含多糖、酚类、色素等物质而导致RNA提取效率和成功率不高的缺陷，利用上述方法，植物组织RNA的提取效率和成功率显著提高，同时发明专利技术人发现，相比于现有技术，节约了约80％的样品用量，极大方便了微量样品的测序；此外，林木特异性barcode序列的使用提高了测序碱基的平衡度，测序产出至少提高5％，且测序质量也会不同程度的提高。

Method for extracting RNA from forest tissue or organ and method for identifying tissue specific miRNA of forest tissue

The invention provides a method for extracting RNA from forest tissues or organs, a method for designing and identifying the barcode sequence of forest trees, and a method for identifying the tissue-specific microRNAs of forest trees. The methods for extracting RNA from forest tissues or organs include first contact with crosslinked polyvinylpyrrolidone (PVPP) and second contact with Trizol, beta-mercaptoethanol and polyvinylpyrrolidone (PVP). This method avoids the defect of low efficiency and high efficiency of RNA extraction due to the high content of polysaccharides, phenols and pigments in plant tissues. By using this method, the efficiency and efficiency of RNA extraction in plant tissues are significantly improved. At the same time, the inventor found that the amount of sample is saved by about 80% compared with the existing technology. In addition, the use of tree-specific barcode sequences has improved the balance of sequence bases, increased the sequencing output by at least 5%, and improved the sequencing quality to varying degrees.

【技术实现步骤摘要】
提取林木组织或器官RNA的方法和鉴定林木组织特异性miRNA的方法
本专利技术涉及进化生物学研究领域，具体地，本专利技术涉及提取林木组织或器官RNA的方法和鉴定林木组织特异性miRNA的方法。
技术介绍
DNA测序技术在当代生物学领域具有重要的应用价值。自1977年Sanger专利技术链终止法测序方法以来，DNA测序技术经历了迅速发展。随后的二、三代测序技术以高通量为共同特征，也被称为“新一代测序技术(NGS)”。Roche公司的454测序平台、Illumina公司的Solexa测序系统以及ABI公司的SOLID测序系统标志着第二代测序技术诞生，且各平台具有各自的优势。尽管各系统在高通量水平、测序准确度、技术方法上各有差异，但共同特征是大大降低了测序成本并极大地提高了测序通量。然而，二代测序使用激光识别测序反应位点并进行cluster定位，如果测序DNA片段缺少某一种碱基，将会导致图片无法合并以及cluster定位，导致数据浪费。因此设计高效的、物种特异的、具有碱基多样性的条形码序列(barcode)在多样本测序中尤为重要。miRNA可以影响一系列生物学过程，包括生长、发育与分化过程。利用DNA测序技术鉴定miRNA是常用的一种技术。该方法已经成功运用于在人类(Human)、大豆(Soybean)、栓住螺母(Quercussuber)、拟南芥(Arabidopsis)的miRNA发现及单个组织miRNA的探测。然而，组织特异性表达的miRNA因其功能的不确定性主要在动物领域研究较多，植物领域极少研究，尤其是林木领域则是空白。此外，针对林木基因组序列杂合度高，序列复杂，目前没有针对林木的特异条形码序列(barcode)，且没有高效的方法可以同时对林木多个组织表达的miRNA进行高度平行性高通量测序检测。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提供了一种林木组织特异性表达的miRNA的高通量检测方法，该方法与DNA测序手段相比，大大简化了测序流程，本专利技术需要更少的样品量，减少了重复上机测序的次数，由于整个文库构建只需要一次完成，保证了样品间测序较好的均一性，弥补了高通量测序技术检测林木组织性特异表达的miRNA的空白。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种提取林木组织或器官RNA的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将待处理样品与交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)进行第一接触，并在液氮条件下进行研磨处理，将研磨处理后产物与Trizol、β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)进行第二接触。专利技术人发现，在研磨过程中加入交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，PVPP具有崩解的作用，可以以更快的速度裂解细胞，提高研磨效率。PVP中的CO-N＝基有很强的结合多酚的能力，减少了酚类被氧化的机会，且β-巯基乙醇是一种较强的还原剂，使多酚不易被氧化，并可经抽提去除。利用根据本专利技术实施例的上述方法，避免了因植物组织中富含多糖、酚类、色素等物质而导致RNA提取效率和成功率不高的缺陷，利用上述方法，植物组织RNA的提取效率和成功率显著提高，同时专利技术人发现，相比于现有技术，节约了约80％的样品用量，极大方便了微量样品的测序。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括：(1)将第二接触后所得混合物与无水乙醇、KAc和氯仿/异戊醇混合液进行第三接触，冰置处理10min；(2)将步骤(1)所得混合物进行第一离心处理，并将第一离心处理后的上层水相与氯仿进行第四接触，并将第四接触后产物进行震荡、静置和第二离心处理；(3)将步骤(2)第二离心处理后上清与异丙醇和NaAc进行第五接触，并进行冰置、第三离心处理，以便获得RNA粗产物；(4)将步骤(3)所得RNA粗产物进行洗涤处理；(5)将步骤(4)所得洗涤处理产物进行第四离心和干燥处理，将干燥处理后产物与RNase-free水和DNA消化酶进行第六接触，将第六接触后产物进行水浴处理，并将水浴后产物与等体积的氯仿和异戊醇进行第七接触，将第七接触后产物进行第四离心处理；以及(6)将步骤(5)所得第四离心处理后产物与无水乙醇和NaAC进行第八接触，将第八接触后产物进行静置和第五离心处理，收集沉淀物，所得沉淀物为样本RNA产物。专利技术人发现，在上述方法中，通过两次加入NaAC，使多糖溶解，最后在NaCl中再次析出，可有效去除大部分多糖。根据本专利技术的实施例，基于0.1g的待处理样品，所述交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的用量为20mg。所述Trizol的用量为10微升，所述β-巯基乙醇的用量为1体积％，所述PVP的用量为1体积％。专利技术人发现，在上述用量下，对植物组织样品RNA的提取效率进一步提高。根据本专利技术的实施例，在步骤(3)中，所述异丙醇的用量为所述上清总体积的2/3体积。专利技术人发现，在上述用量下，对植物组织样品RNA的提取效率进一步提高。根据本专利技术的实施例，进一步包括：以RNsae-free水为空白对照，使用Nanodrop仪测定所述RNA产物的A260与A280值，基于A260与A280值判定RNA产物的纯度和总量，使用Agilent2100仪测定完整度，基于完整度判定RNA产物的完整性，其中，A260与A280值在2.00-2.08，是RNA产物纯度合格的指示，完整度在7.5～8.6，是RNA产物具有完整性的指示。利用上述方式筛选出的纯度合格和完整性合格的RNA产物用于构建cDNA文库和高通量测序，测序结果更加真实有效，能够更加有效地鉴定林木组织特异性miRNA。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种鉴定林木组织特异性miRNA的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：利用前面所述的方法提取林木组织或器官RNA；利用所提取的RNA构建cDNA文库；基于cDNA文库进行高通量测序；以及根据测序结果及miRNA筛选标准，鉴定林木组织特异性表达的miRNA。本利用根据本专利技术实施例的上述方法，实现了高通量测序技术检测林木组织性特异表达的miRNA，检测效率、成功率和真实性高。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述cDNA文库是通过如下方式构建的：smallRNA两端加林木特异接头-条形码，所述林木特异接头-条形码为接头中含有组织特异性标记序列的条形码。专利技术人发现，林木特异性的接头-条形码序列，降低了碱基的不均一性，提高了碱基复杂度、多样性、测序通量和组织间测序的均一性。根据本专利技术的实施例，所述组织或器官的数量至少为5个。专利技术人发现，随着组织个数的增加，检测到的miRNA数目逐渐增多，但是5个组织之后，趋势明显放缓，说明5个组织已经几乎可以检测到所有的miRNA，因此选择至少5个组织进行物种miRNA的检测。根据本专利技术的实施例，所述林木特异的接头-条形码序列包括正链和负链，所述正链具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述负链具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXATGTGACTGGCCA(SEQIDNO：1)。GTCAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG(SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取林木组织或器官RNA的方法，其特征在于，包括：将待处理样品与交联聚乙烯吡咯烷酮进行第一接触，并在液氮条件下进行研磨处理，将研磨处理后产物与Trizol、β‑巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮进行第二接触。

【技术特征摘要】
1.一种提取林木组织或器官RNA的方法，其特征在于，包括：将待处理样品与交联聚乙烯吡咯烷酮进行第一接触，并在液氮条件下进行研磨处理，将研磨处理后产物与Trizol、β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮进行第二接触。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：(1)将第二接触后所得混合物与无水乙醇、KAc和氯仿/异戊醇混合液进行第三接触，冰置处理10min；(2)将步骤(1)所得混合物进行第一离心处理，并将第一离心处理后的上层水相与氯仿进行第四接触，并将第四接触后产物进行震荡、静置和第二离心处理；(3)将步骤(2)第二离心处理后上清与异丙醇和NaAc进行第五接触，并进行冰置、第三离心处理，以便获得RNA粗产物；(4)将步骤(3)所得RNA粗产物进行洗涤处理；(5)将步骤(4)所得洗涤处理产物进行第四离心和干燥处理，将干燥处理后产物与RNase-free水和DNA消化酶进行第六接触，将第六接触后产物进行水浴处理，并将水浴后产物与等体积的氯仿和异戊醇进行第七接触，将第七接触后产物进行第四离心处理；以及(6)将步骤(5)所得第四离心处理后产物与无水乙醇和NaAC进行第八接触，将第八接触后产物进行静置和第五离心处理，收集沉淀物，所得沉淀物为样本RNA产物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于0.1g的待处理样品，所述交联聚乙烯吡咯烷酮的用量为20mg，所述Trizol的用量为10微升，所述β-巯基乙醇的用量为1体积％，所述聚乙烯吡咯烷酮的用量为1体积％，任选地，在步骤(3)中，所述异丙醇的用量为所述上清总体积的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德强，谢剑波，张全锋，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11