一种固定化脂肪酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化脂肪酶及其制备方法。本发明专利技术用1.0mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/mL的酶液，10000r/min离心后得到澄清酶液，按照5.0g：4mL的比例将型号为LXEP‑120的环氧树脂置于酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶；其酶活约为400U/g，酶活回收率达到92.79％，具有良好的pH耐受性、温度耐受性、操作稳定性以及储存稳定性，符合工业应用的需要。

Immobilized lipase and preparation method thereof

The invention discloses a immobilized lipase and a preparation method thereof. The enzyme solution with a concentration of 2.0 mg/mL was prepared by dissolving the lipase powder with a pH of 6.0 mol/L of potassium phosphate buffer. The clarified enzyme solution was obtained after centrifugation for 10 000 r/min. According to the ratio of 5.0 g:4 mL, the epoxy resin of type LXEP_120 was immobilized in the enzyme solution for 12 hours at 150 rpm and 22 ~C, and then the enzyme solution with a pH of 1.0 mol/L was 6.0 H. The immobilized lipase was obtained by dissolving and washing three times with potassium phosphate buffer and drying at 40 C. The enzyme activity was about 400 U/g and the recovery rate was 92.79%. The immobilized lipase had good pH tolerance, temperature tolerance, operation stability and storage stability, which met the needs of industrial application.

【技术实现步骤摘要】
一种固定化脂肪酶及其制备方法
本专利技术属于生物化工和生物
，具体涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法。
技术介绍
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，是一类十分重要的生物催化剂，能分解底物产生各种天然油脂。作为一种生物催化剂，脂肪酶具有催化效率高、专一性强、副产物少、反应条件温和的特点，被广泛地应用到手性化合物的拆分、生物柴油的制备、食品加工和日用化工等行业。但是，由于游离酶本身存在的稳定性差、分离回收困难和难以实现反复连续利用等缺陷，很大程度上限制了其在工业生产中的实际应用。为了解决游离酶存在的以上缺点，真正将酶制剂应用到工业生产中去，人们开展了酶的固定化研究。酶的固定化方法有多种，较为常用的有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。共价结合法固定化酶是把酶的非活性侧链基团和载体中的活性官能团共价键合，固定化得到的酶通常具有良好的稳定性，在连续使用的过程中酶活损失较小，是目前较为受青睐的一种固定化方法。利用共价键固定化的官能团载体有很多种，较为常用的有羧基类、氨基类和环氧基类。由于环氧基团具有很高的活性和可塑性，在常温下就可以与酶蛋白表面的氨基酸残基(-NH2、-COOH、-HS等)发生温和的开环共价结合，从而将酶分子固定在载体表面。并且，由于一些合成的树脂载体在较长的生产周期内具有很强的耐微生物、耐碱腐蚀作用和较强的机械性能，所以利用含有环氧基团的树脂来固定化酶，在通常情况下可以得到稳定性较好、机械性能较强的固定化酶，能够较好地适应复杂的工业操作环境。目前，用于工业酶固定化的环氧树脂主要是EupergitC等国外公司生产的环氧树脂，但是国外进口的环氧树脂价格较为昂贵，从国外进口需要花费大量的外汇资源。因此，开发基于国产环氧树脂进行工业酶的固定化方法，以减少对国外公司生产的昂贵的环氧树脂的依赖，很有必要。而目前基于环氧树脂载体的固定化脂肪酶的报道较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了减少对国外公司生产的昂贵的环氧树脂的依赖，利用国产的环氧树脂替代进口的环氧树脂，通过优化固定化过程，得到性能更为优异的环氧树脂固定化脂肪酶，提供一种经济实用的固定化脂肪酶及其制备方法。本专利技术通过对国产的环氧树脂进行筛选，使用国产环氧树脂LXEP-120固定化脂肪酶，研究了影响固定化效果的多个重要参数，确定了最佳的固定化工艺，并分析了制备的环氧树脂固定化脂肪酶的酶学性质以及稳定性。本专利技术的第一个目的是提供一种固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：将脂肪酶溶于pH5.5～8.5的缓冲液中，10000r/min离心得到脂肪酶酶液，按照环氧树脂：脂肪酶酶液为0.5～7g：4mL的比例将环氧树脂放入酶液中，在18～28℃条件下固定化12～24h；然后洗涤、抽滤、干燥。优选，所述的环氧树脂为环氧树脂LXEP-120、LX-1000EP、ES-1、ES-3、ES-5或ES-7。更优选的，所述的环氧树脂为环氧树脂LXEP-120。优选，所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。优选，所述的缓冲液为浓度为1.0mol/L的pH6.0的磷酸钾缓冲液。优选，所述的酶液浓度为2mg/mL，环氧树脂：脂肪酶酶液的比例为5g：4mL。优选，所述的固定化温度为22℃、固定化时间为12h。优选，所述的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：用1.0mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/mL的酶液，10000r/min离心12min后得到澄清酶液，按照5g：4mL的比例将型号为LXEP-120的环氧树脂置于酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶。本专利技术的第二个目的是提供利用上述的任意一项固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶。本专利技术的第三个目的是提供所述的固定化脂肪酶在催化酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应中的应用。本专利技术制备的固定化脂肪酶的酶活为400U/g，酶活回收率为92.79％，最适反应pH为8.0，最适反应温度为45℃，具有很好的pH耐受性、热稳定性和操作稳定性；且具有较好的储存稳定性，在4℃条件下储存一个月后仍保持80％左右的酶活。此外，该固定化脂肪酶具有较高的重复利用率，重复操作10次后，固定化脂肪酶的酶活力保留原来的70％左右。附图说明图1是缓冲液类型对脂肪酶固定化的影响；图2是缓冲液pH对脂肪酶固定化的影响；图3是缓冲液浓度对脂肪酶固定化的影响；图4是树脂投放量对脂肪酶固定化的影响；图5是固定化温度对脂肪酶固定化的影响；图6是固定化时间对脂肪酶固定化的影响；图7是游离酶和固定化脂肪酶的最适反应pH；图8是游离酶和固定化脂肪酶的最适反应温度；图9是游离酶和固定化脂肪酶的pH耐受性；图10是游离酶和固定化脂肪酶的温度耐受性；图11是固定化脂肪酶的操作稳定性；图12是固定化脂肪酶的储存稳定性。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例中所采用的脂肪酶(ACS号：001-62-1，植物来源脂肪酶)，购自深圳恒生生物有限公司。该脂肪酶可以水解甘油三酯等酯类生产甘油和脂肪酸，在食品、农业、制药和环保等领域具有重要的工业应用价值，可以催化甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。脂肪酶活力测定：①依次在试管中加入1.0mL橄榄油底物乳化液，1.25mL磷酸缓冲液(pH＝8.0)，于40℃恒温水浴5min。②迅速加入0.25mL40℃预热5min的1mg/mL或2mg/mL脂肪酶溶液(或，在测定固定化脂肪酶酶活时，加入0.05g固定化脂肪酶)，置于摇床中反应15min，反应条件为40℃，200r/min。③反应15min后迅速加入6mol/L的盐酸溶液0.5mL，95％的乙醇3mL终止反应，混合均匀后加入1.5mL异辛烷溶液，在涡旋振荡器上震荡90s，60℃水浴条件下静置10min，然后常温水浴中冷却5min。④移取0.5mL上层异辛烷溶液，加入异辛烷2mL，铜盐显色剂0.5mL，于涡旋振荡器震荡90s，然后室温静置直到上层溶液澄清。⑤取上层澄清溶液100uL于酶标仪在714nm波长条件下测定吸光度。对照实验为底物反应15min后加入乙醇和盐酸溶液后，再加入相同体积的酶液，其它操作皆与实验组相同。所述的橄榄油底物乳化液的配置：称取40gPVA(聚合度为1750+50)，加入800mL去离子水，置于沸水浴中搅拌加热，直到全部溶解，除去少数不溶物质后冷却，然后定容到1000mL，得到4％的PVA溶液。取30mL制备好的4％的PVA溶液，加入10mL橄榄油，摇匀后用超声破碎仪分散10min。超声工作条件为：功率36％，工作6s，暂停4s。重复3次操作，得到乳白色的橄榄油底物乳化液。实施例1：固定化脂肪酶的获得1.1不同环氧树脂对脂肪酶固定化的影响分别取1g不同的环氧树脂(环氧树脂LXEP-120、LX-1000EP、ES-1、ES-3、ES-5、ES-7)，加入4mL酶液(pH＝7.0的50mmol/L磷酸钠缓冲液溶解，酶液浓度2mg/mL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脂肪酶溶于pH 5.5～8.5的缓冲液中，10000r/min离心得到脂肪酶酶液，按照环氧树脂：脂肪酶酶液为0.5～7g：4mL的比例将环氧树脂放入酶液中，在18～28℃条件下固定化12～24h；然后洗涤、抽滤、干燥。

【技术特征摘要】
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脂肪酶溶于pH5.5～8.5的缓冲液中，10000r/min离心得到脂肪酶酶液，按照环氧树脂：脂肪酶酶液为0.5～7g：4mL的比例将环氧树脂放入酶液中，在18～28℃条件下固定化12～24h；然后洗涤、抽滤、干燥。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的环氧树脂为环氧树脂LXEP-120、LX-1000EP、ES-1、ES-3、ES-5或ES-7。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的环氧树脂为环氧树脂LXEP-120。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为浓度为1.0mol/L的pH6.0的磷酸钾缓冲液。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡云峰，徐珊，李任强，张继福，张云，孙爱君，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44