一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体，本发明专利技术提供的与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术基于富集的配体系统进化技术，经过多轮的富集筛选，筛选出与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体。基于该核酸适配体设计传感器,利用流式细胞术建立了检测(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的检测方法。本发明专利技术的核酸适配体及检测方法可用于快速检测(1,3)‑β‑D‑葡聚糖并应用于制备侵袭性真菌感染辅助诊断的检测试剂中,为侵袭性真菌感染诊断提供了新的思路,具有良好的应用前景。

Aptamer specifically binding to (1,3) - -D- glucan and its application

The invention relates to the field of biotechnology and discloses a nucleic acid aptamer specifically bound to (1,3) beta_D_glucan. The DNA sequence of the aptamer specifically bound to (1,3) beta_D_glucan provided by the invention is shown in SEQ ID NO.1. Based on the enriched ligand system evolution technology, the nucleic acid aptamers specifically binding to (1,3) beta_D_glucan were screened through multiple rounds of enrichment and screening. Based on the aptamer designed sensor, a flow cytometry method for the detection of (1,3) beta D_glucan was established. The nucleic acid aptamer and detection method of the present invention can be used for rapid detection of (1,3) beta_D_glucan and for preparation of detection reagents for auxiliary diagnosis of invasive fungal infections, providing a new idea for the diagnosis of invasive fungal infections, and having a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用。
技术介绍
深部真菌感染(Invasivefungalinfection,IFI)是指真菌侵入人体组织、血液或器官，并在其中生长繁殖引起组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。近年来，由于免疫抑制剂、广谱抗生素、糖皮质激素、抗肿瘤药物等的广泛使用及外科手术导管、置管的应用，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐渐增多。由于IFI的临床症状和体征缺乏特异性，确诊主要依赖组织病理学，在临床上往往较难获得，而真菌培养对取材要求高、时间长、阳性率低，导致侵袭性真菌感染的早期诊断非常困难。因此，临床上急需建立一种敏感、特异且操作便捷的用于诊断真菌感染检测方法。(1,3)-β-D-葡聚糖是除接合菌外所有真菌细胞壁的结构成分，在酵母样真菌中含量最高，约占细胞壁干重的50％-60％，而原核生物、病毒和人类细胞均不含此多糖。真菌侵入人体时，宿主细胞会对真菌进行氧化处理，真菌破壁后持续释放出可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖进入血液。目前应用广泛的检测真菌壁成分—(1,3)-β-D-葡聚糖的方法是G试验，其机制是(1,3)-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变性细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固。但是G试验具有一定的局限性，其酶促反应容易受到很多因素的影响，易受到内毒素、药物等干扰，假阳性率高。核酸适配体是指利用富集的配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)，从随机单链核酸库中筛选出来的能与相应的靶分子高亲合性、高特异性结合的寡核苷酸片段。适配体可以是一段脱氧核苷酸或核苷酸序列，具有丰富多样的三维结构，可模拟几乎所有可能存在的与靶分子相互作用的空间结构，如发卡、假节、四聚体、I-基序、茎环等，其结合的靶分子可以是蛋白质、糖类、细胞因子、小分子毒素、病毒、细菌、金属离子等，因此核酸适配体被广泛应用于生物传感器等领域。同时适配体为核苷酸序列，容易制备和修饰，结构活性稳定，并且其分子量小，与靶分子的立体结构域进行结合，可进行分子改造，为生物化学及生物医学发展提供了一种快速识别的研究平台，并展示出良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于(1,3)-β-D-葡聚糖检测的核酸适配体及其应用。要实现对(1,3)-β-D-葡聚糖快速定性和定量检测，需要获取到能与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合且亲和力高的物质。为实现上述目的，本专利技术提供一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，所述核酸适配体的DNA序列如SEQIDNO.1。进一步地，由于适配体的可修饰性，可以通过不同的修饰达到不同的目的，还可对本专利技术提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列进行修饰、延长或截短，例如修饰材料可以为荧光物质、生物素、纳米物质及相关酶类物质等。进一步地，本专利技术所述的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体的序列为SEQIDNO.1所示的DNA序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸后形成与SEQIDNO.1具有同等功能的序列。本专利技术提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体可应用于制备对(1,3)-β-D-葡聚糖定性和定量检测的试剂中，这些检测试剂可以基于但不限于以下检测方法；荧光方法检测、酶联免疫反应、放射免疫检测、免疫印迹检测、流式细胞术检测等。本专利技术的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体还可应用于对侵袭性真菌感染的辅助诊断试剂的制备中。本专利技术还提供一种对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，包含以下步骤：⑴将前述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记并与过量含有淬灭基团标记的DNA孵育，所述核酸适配体与该DNA链部分互补；⑵将其与预处理的链霉亲和素磁珠孵育；⑶清洗除去过量DNA；⑷将含有(1,3)-β-D-葡聚糖的样品加入上述体系孵育；⑸对检测样品荧光强度进行分析。进一步地，所述对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法中所述的含有淬灭基团标记的DNA为可以为5′-CATTGGGCTTGG-BHQ1。进一步地，所述的对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法中所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记形成如下结构：5′-FAM-TCCAAGC-[本专利技术提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列]-TTTTTT-Biotin。本专利技术有以下有益效果：(1)本专利技术借助富集的配体进化系统，利用商品化的链酶亲和素磁珠与人工偶联生物素标记(1,3)-β-D-葡聚糖进行结合筛选，再经过PCR扩增结合的核酸序列，经多轮的富集筛选，最终获得与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体；经过人工合成序列检测，该核酸适配体可与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合，并可实现对(1,3)-β-D-葡聚糖的定性及定量检测；(2)常规抗体一旦筛选完成，难于进行特定改造；本专利技术所提供的核酸适配体可经过商业公司合成或PCR扩增获得，可进行定点改造，易于人工合成和标记，成本低；(3)利用本专利技术提供的核酸适配体能建立检测(1,3)-β-D-葡聚糖的检测方法，通过相应检测标定物的偶联，进行(1,3)-β-D-葡聚糖快速定性及定量检测。附图说明图1A为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的苯酚-硫酸法检测结果图(1，阴性对照；2，(1,3)-β-D-葡聚糖(+))；图1B为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的碘反应检测结果图(1，阳性对照；2，阴性对照；3，(1,3)-β-D-葡聚糖(-))；图1C为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的茚三酮反应结果图(1，(1,3)-β-D-葡聚糖(-)；2，阳性对照)；图1D为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的红外图谱；图1E为具体实施例中对提取的(1,3)-β-D-葡聚糖进行定量检测使用的葡萄糖标准曲线；图2A为具体实施例中(1,3)-β-D-葡聚糖的生物素标记、纯化鉴定使用的不同分子量的葡聚糖标准曲线；图2B为具体实施例中生物素化(1,3)-β-D-葡聚糖的红外图谱；图3为本专利技术SELEX筛选过程中ssDNAPCR电泳结果图(ASELEX筛选中ssDNAPCR扩增电泳结果图；B负筛选中ssDNA与链霉亲和素磁珠孵育的PCR扩增电泳结果图)；图4为本专利技术的核酸适配体及其它各组核酸适配体对(1,3)-β-D-葡聚糖结合力检测结果图；图5为本专利技术的核酸适配体的二级结构示意图；图6为本专利技术的核酸适配体解离常数(Kd值)的检测结果图；图7为流式细胞术对本专利技术的核酸适配体与(1,3)-β-D-葡聚糖亲和力检测结果图；图8为流式细胞术对本专利技术的核酸适配体检测(1,3)-β-D-葡聚糖特异性实验结果图。具体实施方式以下结合实施例和附图对本专利技术作进一步的详细说明。国内申请号为201610902299.9专利技术专利申请公布了特异性结合白色念珠菌ATCC10231中(1,3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的DNA序列如SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的DNA序列如SEQIDNO.1。2.如权利要求1所述的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列经过修饰、延长或截短。3.如权利要求1所述的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸后形成与SEQIDNO.1具有同等功能的序列。4.如权利要求1-3所述的任一与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体在制备(1,3)-β-D-葡聚糖的定性、定量检测试剂中的应用。5.如权利要求1-3所述的任一核酸适配在制备对侵袭性真菌感染的辅助诊断试剂中的应用。6.一种对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，包含以下步骤：⑴将权利要求1-3所述的任一与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记并与过量含有淬灭基团标记的DNA孵育，所述核酸适...

【专利技术属性】
技术研发人员：林勇平，杨敏，陈源，刘忠民，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东,44