本发明专利技术公开了一种西瓜籽粒大小基因及其SNP分子标记和应用。该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1，编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2；还设计了与所述基因具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的基因；明确了一种所述西瓜籽粒大小基因共分离的SNP位点，位于西瓜基因组6号染色体5418365bp处，其碱基由G突变为A；设计SNP位点的dCAPs分子标记；设计一种西瓜籽粒大小基因型的鉴定方法，将西瓜籽粒大小基因或dCAPs分子标记在西瓜籽粒大小分子标记辅助筛选和育种中应用。可为鉴定西瓜籽粒大小提供新手段，加速西瓜籽粒大小性状的改良进程。
【技术实现步骤摘要】
西瓜籽粒大小基因及其SNP分子标记和应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种西瓜籽粒大小基因及其SNP分子标记和应用。
技术介绍
西瓜的第一用途是鲜食，果肉是食用部分，籽粒偏大影响食用，消费者喜欢无籽或是籽粒较小的西瓜，因此小粒品种是栽培西瓜的育种目标之一。西瓜的另一用途是籽用，种子是籽用西瓜主要的产品。研究表明，籽用西瓜种子是优质的蛋白质和植物油资源，并含有丰富的维生素D，因此，大粒品种是籽用西瓜的主要育种目标。在大量资源搜集和数据采集的过程中，本专利技术人发现大粒的通常是野生西瓜、粘籽西瓜和地方品种，其品质往往比较差；小粒多为普通栽培西瓜，品质较好，不同品种间种子籽粒大小差异明显，因此籽粒大小也是西瓜的一个主要分类性状。国内外西瓜籽粒大小的研究主要集中在对控制种子大小、千粒重的基因进行传统的遗传分析。Weetman(1937)和尚建立等（2015）的研究表明粒重倾向于单基因控制的质量性状。张杨（2013）和周延峰（2014）的研究均表明粒重都是受一对主基因控制。Pool等（1941）发现了l和s这一对控制种子长短的等位基因，Kensler等（1958）和Shimotsuma等（1963）的研究也证实了这一结果。然而，Tanaka等（1995）发现了控制小粒的基因Ti，与l和s为非等位基因。Zhang等（1996）的研究表明tomato西瓜种子由单隐性基因ts控制。虽然采用的试验材料与方法不同，所得结论也不完全一致，但这些研究有一些共同点，都认为种子大小属于质量性状，小粒种子显性于大粒种子，且由单基因控制。另一方面，翟文强等（1995）以粒重具有显著差异的两个西瓜高代自交系为亲本研究杂交后代的粒重，西瓜种子千粒重表现为数量性状遗传的特点。Prothro等（2012）利用重组自交系和F2群体研究籽粒大小，表明粒重是典型的数量性状。传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制质量/数量性状的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个质量/数量性状基因在染色体上位置及效应(徐云碧,1992)。随着分子标记技术发展和分子数量遗传学的完善，近些年来，一批QTL定位的工作已经进行（范敏等，2000；Hawkins等，2001；易克，2002；Prothro等，2012；Meru和McGregor，2013），以期揭示西瓜籽粒大小的遗传基础，但是这些研究所定位的区间较大，候选基因多且难以筛选，至今没有一个西瓜籽粒大小基因得以确定。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种西瓜籽粒大小基因及其SNP分子标记和应用，以揭示西瓜籽粒大小的遗传基础，确定西瓜籽粒大小的基因。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：筛选出一种西瓜籽粒大小基因，命名为ClamdtK，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO.2所示。设计一种与所述西瓜籽粒大小基因具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的基因。明确一种所述西瓜籽粒大小基因共分离的SNP位点，位于西瓜基因组6号染色体5418365bp处，其碱基由G突变为A。设计一种所述SNP位点的dCAPs分子标记，其上游引物命名为dcaps9_S6F，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其下游引物命名为dcaps9_S6R，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该引物酶切反应所用限制性内切酶为TagI。设计一种西瓜籽粒大小基因型的鉴定方法，包括以下步骤：a.DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；b.PCR扩增：反应体系为：100ng/μL西瓜植株总DNA1μL、dcaps9_S6F1μL、dcaps9_S6R1μL、2×PowerTaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O9.5μL；反应程序为：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min；c.酶切反应体系和程序：反应体系为：PCR产物5μl，TagI限制性内切酶0.5μl，10Xbuffer1.5μl，ddH2O8μl。反应程序为：65℃恒温处理10小时。d.电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，142bp的条带代表大籽粒基因型，113bp的条带代表小籽粒基因型。将所述西瓜籽粒大小基因或所述基因在西瓜籽粒大小基因克隆或表达中的应用。将所述基因、所述SNP位点或所述的dCAPs分子标记在西瓜籽粒大小分子标记辅助筛选和育种中的应用。上述应用包括如下步骤：（1）对F2群体每个株系利用所述分子标记进行基因型鉴定；（2）利用上述（1）中F2群体的基因型鉴定结果，根据分子标记的基因型对不同单株进行分类，并利用籽粒表型数据进行鉴定和验证。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术利用正向遗传学的方法首次公开了西瓜多药抗性蛋白基因ClamdtK在调控种子大小的功能中的应用。2.本专利技术设计了一个西瓜籽粒大小基因共分离的分子标记，应用该标记进行分子标记辅助选择育种，能以更快速、准确的进行西瓜籽粒大小的定向遗传改良。3.本专利技术在西瓜籽粒大小育种中进行了应用，可为鉴定西瓜籽粒大小提供新手段，进而加速西瓜籽粒大小性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。附图说明图1为6个差异表达基因RT-PCR验证情况；图2为ClamdtK在RIL_L和RIL_S中不同发育时期的基因表达量；图3为利用籽粒大小标记dcaps9_S6的引物在部分F2群体基因组DNA中的扩增结果图；其中，方框中条带为父母本的目的条带，名称皆为品种名称/代号的后两/三位。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：西瓜籽粒大小基因的确定及分子标记的开发1.西瓜籽粒大小主效QTL的精细定位利用西瓜大粒母本“ZXG01478”和小粒父本“14CB11”杂交获得F2群体构建的高密度的遗传连锁图谱，对父母本、F1和F2群体的93个单瓜进行籽粒大小的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和F2群体表型鉴定结果，利用Rqtl-IM-binary方法进行QTL初定位，鉴定到籽粒大小的主效QTL，其LOD峰值为46.94，解释26.16%的表型变异，置信区间（2-LOD）为3.68～31.67cM。2.籽粒大小相关的比较转录组学分析（1）利用西瓜大粒母本“ZXG01478”和小粒父本“14CB11”构建重组自交系（RILs），筛选其中一份大粒（RIL_L）和一份小粒（RIL_S）花后7、8、9、10、11、12和13天（DAF）的种子进行转录组测序。14个样品转录组测序的基本信息如表1所示。Q30都大于90%，且GC含量与西瓜参考基因组基本一致。表1转录组测序的基本信息。（2）分别利用不同发育时期的RIL_L和RIL_S进行差异表达分析，并随机挑选6个差异表达基因利用RT-PCR进行验证。结果如图1所示，RT-PCR很好的验证了转录组分析的结果，说明转录本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种西瓜籽粒大小基因ClamdtK，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种西瓜籽粒大小基因ClamdtK，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO.2所示。2.一种与权利要求1所述西瓜籽粒大小基因具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的基因。3.一种权利要求1所述西瓜籽粒大小基因共分离的SNP位点，其特征在于，位于西瓜基因组6号染色体5418365bp处，其碱基由G突变为A。4.一种权利要求3所述SNP位点的dCAPs分子标记，其特征在于，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。5.依据权利要求4所述SNP位点的dCAPs分子标记，其特征在于，所述引物酶切反应所用限制性内切酶为TagI。6.一种西瓜籽粒大小基因型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：a.DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；b.PCR扩增：反应体系为：100ng/μL西瓜植株总DNA1μL、权利要求4所述上游引物1μL、权利要求4所述下游引物1μL、2×PowerTaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O9.5μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，马双武，尚建立，王吉明，周丹，李楠楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41
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