本发明专利技术公开了一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，将丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因应用在提高植物耐铝能力中；实验证明丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75具有提高烟草植物耐铝性的功能；GmMATE75基因在酸性土壤植物抗铝毒胁迫中具有的应用价值，可用于植物耐铝分子机理研究和作物抗铝毒分子育种领域。
A soybean protein citric acid transporter gene and its application
The present invention discloses a citrate transporter gene GmMATE75 of Danbo Black soybean. Its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1 and encodes the amino acid sequence as SEQ ID NO:2. The citrate transporter gene of Danbo Black soybean is applied to improve the aluminum tolerance of plants. The white gene GmMATE75 can improve the aluminum tolerance of tobacco plants, and the GmMATE75 gene has application value in the aluminum tolerance of plants in acidic soils. It can be used in the research of molecular mechanism of aluminum tolerance of plants and molecular breeding of aluminum tolerance of crops.
【技术实现步骤摘要】
一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因及其应用
本专利技术涉及分子生物学及基因工程相关
，涉及一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75及其在提高植物耐铝性中的应用。
技术介绍
铝胁迫是酸性土壤上影响作物生长的最主要的因素之一。铝作为地壳中含量最为丰富的矿质元素之一广泛分布于土壤之中。一般情况下，铝对作物的生长不会有较大的影响，但是随着pH的降低，铝会以有毒害的离子形态存在于土壤当中。当酸性土壤中Al3+的浓度达到微摩尔浓度时，便会通过抑制作物根部生长的方式影响作物对水分和矿质养分的吸收，从而抑制作物的生长，导致酸性土壤上作物的大面积减产。传统施用石灰中和酸性土壤的方法在一定程度上可以缓解土壤的酸性，从而降低铝毒毒害。但这种方法成本较高，无法大范围实施，并且只能中和表面土壤的酸性起到暂时的成效，而不能从根本上解决铝毒问题。因此，从分子水平分析酸性土壤上铝毒毒害的机理，运用基因工程相关技术培育抗铝毒农作物具有重要的理论价值和实践意义。大部分耐铝的单子叶和双子叶植物都可以通过根系释放有机酸应对铝胁迫；植物根部分泌的有机酸能与质外体中的Al3+结合为螯合态，并将其排出，从而降低或排除Al的毒性；同一物种的耐铝毒品系通常比铝毒敏感品系分泌更多的有机酸。柠檬酸转运蛋白即MATE蛋白在原核生物和真核生物中都属于一个大的基因家族，通过离子电化学梯度运输次生代谢产物和毒素。高粱的SbMATE基因对应于抗铝毒的主要QTL位点AltSB，是经图位克隆获得的第一个MATE家族的抗铝毒基因，在拟南芥中过量表达时能引起Al3+激活的柠檬酸外排，同时伴随抗铝毒能力的增加。此外，HvAACT1也编码MATE类蛋白，在抗铝毒基因型大麦的根尖部位组成型表达，Al3+能激活HvAACT1外排柠檬酸，另外有10个不同的大麦品系抗铝毒的能力与其根系柠檬酸的分泌量正相关，说明HvAACT1作为Al3+激活的柠檬酸转运蛋白在大麦抗铝毒方面起着重要作用。小麦中一个MATE基因的序列表达标签的表达与这个分离群体柠檬酸分泌的表现型相关，说明小麦中也存在类似的通过分泌柠檬酸对抗铝毒胁迫的机制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，基因全长为1288bp，编码如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本专利技术从耐铝性丹波黑大豆中获取柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，通过PCR特异扩增出了该基因的完整片段；回收纯化GmMATE75基因片段，将其连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经酶切检测后获得重组载体pMD18-T-GmMATE75；通过酶切pMD18-T-GmMATE75载体并与载体pENTR-2B进行连接，转化大肠杆菌DH5α，并提取质粒获得入门克隆载体pENTR-2B-GmMATE75；通过Gateway技术的LR反应把GmMATE75基因亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得植物表达载体pK2-35S-GmMATE75，该载体含有增强型启动子，可在受体植物中过量表达目的基因。利用根癌农杆菌介导法，首先将pK2-35S-GmMATE75载体转入农杆菌感受态细胞，之后用浸染法将目的基因转入到受体烟草植株中，利用植物组织培养的方法获得过量表达该基因的转基因型植株，并通过进一步实验验证该基因是否具有提高植物抗铝毒能力的特性；结果表明过量表达该基因的烟草相对于野生型烟草有更强的耐铝毒特性。本专利技术所提供的基因可提高植物对铝胁迫的抗性，同时该专利技术可用于植物抗铝胁迫分子机理的研究以及抗铝胁迫植物的分子育种领域。附图说明图1为从铝处理后的丹波黑大豆中扩增GmMATE75基因片段的电泳图，图中M为DNAMarker，1为GmMATE75基因片段；图2为GmMATE75型烟草在铝胁迫下的根相对伸长率测定结果示意图；图3为GmMATE75型烟草经铝处理后细胞中可溶性糖含量测定结果示意图，其中A图为叶片中多糖含量，B图为根部多糖含量；图4为GmMATE75型烟草经铝处理后细胞中过氧化氢含量测定结果示意图，其中A图为叶片中过氧化氢含量，B图为根部过氧化氢含量。具体实施方式下面所述的实施例中的试验方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂以及按常规方法配置的试剂。实施例1：GmMATE75转基因烟草株系的构建取丹波黑大豆水培幼苗，用50μMpH4.5的AlCl3溶液处理24h，取其叶片用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5μgTotalRNA，依次加入50ngoligo（dT），2μLdNTP（2.5mMeach）、DEPC水至反应体积为14.5μL；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μL5×First-standbuffer、0.5μLRNasin（200U）、1μLM-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应；cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。以合成的cDNA为模板用GmMATE75特异性引物进行PCR扩增GmMATE75基因；设计特异性引物如下：MA75-F：CGGGATCCCGATGGACGAGAATAGAAGTTCCAAC，GGATCC为BamHI酶切位点；MA75-R：CCGCTCGAGCGGTCATTTGCAGTGTCCTTGTTGCTG，CTCGAG为XhoI酶切位点；PCR反应条件：95℃4min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；反应体系（20μL）为1μLcDNA、2μL10×Advantage2PCRBuffer、1.8μL50×dNTPMix（10mMeach）、0.2μL正向引物（10μM）、0.2μL反向引物（10μM）、0.2μLAdvantage2PCRPolymeraseMix、14.6μLPCR-Gradewater；PCR结束后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小，结果与目的基因大小相符（见图1）。采用琼脂糖凝胶回收法获取该DNA片段，连接至pMD18T克隆载体，使用的试剂盒为pMD18-Tvectorkit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5μLPCR产物，依次加入1μLpMD18-Tvector（50ng/μL）和2.5μL2×LigationsolutionI，混匀后置于16℃过夜反应；采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中；使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，菌落PCR检测正确后提取质粒。采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶（TaKaRa）对质粒pMD-18T-GmMATE75和pENTR-2B进行双酶切（100μL体系），反应体系和操作过程为：取20μLpMD-18T-GmMATE75和pENTR-2B质粒、依次加入10μL酶切缓冲液、相应内切酶各5μL、60μLddH2O，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，编码如 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，编码如...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，郝竞一，吴远双，陈丽梅，徐慧妮，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。