玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因，包含：SEQ ID No.１～４中的任意一个所示的核苷酸序列，或者与其互补或者同一性的核苷酸序列、活性片段等。本发明专利技术还涉及所述恢复基因的启动子、表达多肽、重组构建体、宿主细胞及其在作物改良中的应用。本发明专利技术玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因既可解决人工因素的限制，又能有效弥补传统玉米育种选择技术准确率低和时效性差的缺点，加快育种进程。

Nuclear restorer gene of C cytoplasmic male sterility in maize and its application

The invention belongs to the field of genetic engineering technology, and specifically relates to a type C cytoplasmic male sterile nucleus restoring gene of maize, which comprises any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID No.1-4, or complementary or identical nucleotide sequences, active fragments, etc. The invention also relates to the promoter of the restorer gene, the expression polypeptide, the recombinant constructor, the host cell and the application thereof in crop improvement. The C-type cytoplasmic male sterile nucleus restoring gene of the invention can not only solve the limitation of artificial factors, but also effectively remedy the shortcomings of low accuracy and poor timeliness of traditional maize breeding selection technology, and accelerate the breeding process.

【技术实现步骤摘要】
玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因及其应用。
技术介绍
玉米是世界范围内利用杂种优势最成功的作物之一，而高纯度、高质量杂交玉米种子的生产是保证杂种优势利用的必要前提。由于玉米具有雌雄同株异花的生物学特性，可以采用人工去雄或机械去雄等方式进行杂交种子生产，但是随着人工成本的不断增加，人工去雄成本已经成为杂交种子成本高低的一个关键因素，在一定程度上制约着我国种子企业的国际竞争力。此外，由于人工去雄的不及时、不彻底，往往造成杂交种子的纯度下降，从而在一定程度影响玉米的产量。机械去雄可节约人工成本，但是由于田间植株生长不一致，同样需要人工复查去雄是否彻底，从而在生产上仍需增加一部分人工成本。玉米是我国第一大粮食作物，常年播种面积5亿亩左右，年需种量10亿公斤左右，年制种面积维持在250万亩左右。由于本地留守人口少，去雄季节的用工荒已经成为玉米制种进一步发展的限制因子。雄性不育具有花粉败育、而雌配子正常的遗传特点，根据其遗传特性可以分为细胞质雄性不育和细胞核雄性不育两种类型。细胞核雄性不育的败育发生在减数分裂时期，具有败育彻底，不育性稳定等特点，在利用不育系进行制种中需要利用与核不育基因连锁的胚乳颜色基因或黄绿苗基因进行早期鉴定，由于连锁的紧密程度及人工鉴定的偏差，存在较大的应用风险。为利用核不育基因，美国先锋公司通过巧妙的设计，构建了包含配子致死、颜色显示等基因的载体，通过遗传转化导入母本形成SPT（SeedProductionTechnology）自交系。SPT自交系自交产生1:1比例的非转基因不育系及SPT可育系两种子代，通过荧光筛选，解决了不育系的繁殖问题，有效杜绝了转基因花粉的扩散。随后水稻也开发了相应的SPT技术，表明该技术在未来杂交育种中广阔的应用前景。但昂贵的大型分选设备对于众多中小种子企业来说仍然是一笔不小的投入。玉米中也进行了相关技术的开发尝试，由于转化相对困难、相关专利储备不足，其应用受到一定的限制。玉米是最早利用细胞质雄性不育系进行杂交种子生产的作物，在上个世纪50年代美国玉米生产上已经大面积利用T型胞质雄性不育系进行杂交种子生产，到上个世纪70年代美国生产上利用的杂交种几乎全部采用了不育化进行种子生产，但是由于玉米小斑病T小种的专化性侵染造成小斑病的大流行，T型胞质雄性不育的利用被迫停止。玉米遗传育种学家转而研究利用玉米的C型和S型不育胞质，据报道，美国上世纪90年代左右销售的杂交种子中，不育胞质的占33.9%，其中C型的占22.1%，S型的占11.5%。玉米C型胞质不育具有不育性稳定、易恢复等突出特点，根据线粒体的酶切多态性的差异，玉米C型胞质可以分为CI、CII和CIII三种不育胞质类型，其中CII和CIII不育胞质类型对小斑病C小种不存在专化性侵染，成为玉米杂交种子生产上利用的一种重要类型。玉米C型胞质雄性不育的恢复由两对重叠恢复基因Rf4和Rf5控制，分别位于玉米的第8和第2染色体上，其中恢复基因Rf5还存在一个显性抑制基因Rf-I，该基因被定为在第7染色体上。传统的不育系及恢复系转育主要根据玉米植株散粉期的田间表型鉴定，需要转育6-8代才能完成，选择的时效性在一定程度上受到限制。因此，亟待开发一种新技术，既能解决人工因素的限制，又能弥补传统选择技术准确率低和时效性差的缺点，加快育种进程。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种可恢复玉米C型细胞质育性的基因，既可解决人工因素的限制，又能有效弥补传统玉米育种选择技术准确率低和时效性差的缺点，加快育种进程。为解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术提供一种玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因，其包含以下任意一种的核苷酸序列：（1）SEQIDNo.１～４中的任意一个所示的核苷酸序列；（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在至少中等严格条件下杂交的核苷酸序列；（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；（4）与（1）的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的核苷酸序列；（5）编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQIDNo.7～8中任意一个所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQIDNo.7～8不同的氨基酸序列，或者，与SEQIDNo.7～8中任意一个所示氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列；（6）（1）～（5）任意一个的核苷酸序列的活性片段；（7）与（1）～（5）任意一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；（8）由SEQIDNo.3～4选择性剪切、选择不同转录起始位点或转录终止位点而生成的与SEQIDNo.3～4不同的其他核苷酸序列。其中，Rf4和rf4的其中一种cDNA序列如SEQIDNo.1～2所示，其相关启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.5～6所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.7～8所示。具体参见下表1。表1SEQIDNo：1～8的序列名称及其来源优选地，本专利技术玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因如SEQIDNo：1所示。本专利技术还提供了玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因的启动子，其包含以下任意一种的核苷酸序列；（1）SEQIDNo：5～6任意一个所示的核苷酸序列；（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在至少中等严格条件下杂交的核苷酸序列；（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；（4）（1）～（3）任意一个的核苷酸序列的活性片段；（5）与（1）～（4）任意一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列；（6）由SEQIDNo：3、4不同转录起始后引起SEQIDNo：5、6相应变化的核苷酸序列。本专利技术还提供了包含上述启动子序列的构建体，以及包含该构建体的细胞，其中所述细胞为植物细胞，优选玉米细胞。本专利技术还提供了一种多肽，其由本专利技术所述的恢复基因编码，包含以下任意一种的氨基酸序列：（1）SEQIDNo：7、8中任意一个所示的氨基酸序列；（2）由于一个或多个氨基酸残疾的替代、缺失和/或插入而与SEQIDNo：7、8不同的氨基酸序列；（3）与SEQIDNo：7、8中任意一个所示氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列；（4）（1）或（2）或（3）所述氨基酸序列的活性片段；（5）由本专利技术所述恢复基因编码的氨基酸序列。优选的，所述的蛋白质具有SBP和ANK两个保守结构域；或单独SBP保守结构域。本专利技术还涉及一种重组构建体，其含有本专利技术所述的恢复基因。其中所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述恢复基因的表达载体。本专利技术还涉及一种重组宿主细胞，其含有本专利技术所述的重组构建体，或在其基因组中整合有本专利技术所述的恢复基因。所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选玉米细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。本专利技术还涉及改良作物性状（例如，产生或敲除作物对C型细胞质雄性不育的恢复性）的方法，该方法包括制备含有本专利技术恢复基因，例如，所述方法可以包括：从含有本专利技术恢复基因的重组植物细胞再生转基因植物或者将含有本专利技术恢复基因的植株与另一植株杂交，或者利用包含本专利技术恢复基因的重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因，其特征在于：包含以下任意一种的核苷酸序列：（1）SEQ ID No.1～４中的任意一个所示的核苷酸序列；（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在至少中等严格条件下杂交的核苷酸序列；（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；（4）与（1）的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的核苷酸序列；（5）编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID No.7～8中任意一个所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID No.7～8不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID No.7～8中任意一个所示氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列；（6）（1）～（5）任意一个的核苷酸序列的活性片段；（7）与（1）～（5）任意一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；（8）由SEQ ID No.3～4选择性剪切、选择不同转录起始位点或转录终止位点而生成的与SEQ ID No.3～4不同的其他核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因，其特征在于：包含以下任意一种的核苷酸序列：（1）SEQIDNo.1～４中的任意一个所示的核苷酸序列；（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在至少中等严格条件下杂交的核苷酸序列；（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；（4）与（1）的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的核苷酸序列；（5）编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQIDNo.7～8中任意一个所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQIDNo.7～8不同的氨基酸序列，或者，与SEQIDNo.7～8中任意一个所示氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列；（6）（1）～（5）任意一个的核苷酸序列的活性片段；（7）与（1）～（5）任意一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；（8）由SEQIDNo.3～4选择性剪切、选择不同转录起始位点或转录终止位点而生成的与SEQIDNo.3～4不同的其他核苷酸序列。2.权利要求1所述玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因的启动子，其特征在于：包含以下任意一种的核苷酸序列；（1）SEQIDNo：5～6任意一个所示的核苷酸序列；（2）与（1）的核苷酸序列的互补序列在至少中等严格条件下杂交的核苷酸序列；（3）与（1）的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；（4）（1）～（3）任意一个的核苷酸序列的活性片段；（5）与（1）～（4）任意一个的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚东，汤继华，丁冬，付志远，李卫华，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41