本发明专利技术涉及LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用，属于基因工程领域，在此基础上进一步提供一种提高植物低氮胁迫耐受性的方法，即首先构建含有LEC2转录因子的重组植物表达载体；然后将构建的重组植物表达载体转化到植物组织或细胞中异位表达；培育筛选出低氮胁迫耐受性增强的转基因植株。本发明专利技术首次揭示了LEC2转录因子在提高植物低氮胁迫耐受性方面的新应用，对于提高植物氮肥利用效率，发展节约型农业模式具有重要意义。
Application of LEC2 gene in improving tolerance to low nitrogen stress in plants
The invention relates to the application of LEC2 gene in improving plant tolerance to low nitrogen stress, belonging to the field of genetic engineering, and further provides a method for improving plant tolerance to low nitrogen stress on the basis of which, firstly, a recombinant plant expression vector containing LEC2 transcription factor is constructed, and then the recombinant plant expression vector is transformed. Heterotopic expression in plant tissues or cells; cultivation and screening of transgenic plants with enhanced tolerance to low nitrogen stress. The invention discloses for the first time the new application of LEC2 transcription factor in improving plant tolerance to low nitrogen stress, which is of great significance for improving plant nitrogen utilization efficiency and developing economical agriculture mode.
【技术实现步骤摘要】
LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地，涉及LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用。
技术介绍
氮素不仅是核酸及蛋白质的重要组分，还参与构成叶绿素、各种代谢相关酶等重要物质，是维持植物正常生长发育所必须的“生命元素”。氮素的丰缺、形态差异对于作物的产量与品质有着重要的影响。其中氮素的缺乏会导致植株水分吸收利用率及光合速率下降，生长受抑制，植株矮小，根茎细，分蘖少，花、果实等发育迟缓。充足的氮肥可以保证农作物的产量及品质，但是目前氮肥的滥用不仅造成了大量资源的浪费，还可能会降低作物的产量。只有合理调控作物正常生长发育所需的氮肥，提高氮素的吸收、转运和同化效率以培育耐低氮胁迫的植物，才能保证作物的高产、高效和优质。植物激素是植物体内产生的能够调控植物生长发育的微量有机物质，已有研究表明生长素与低氮胁迫耐受性存在着内在联系。低氮胁迫会促进生长素响应基因的表达，而施加外源生长素可提高植物的低氮胁迫耐受性。此外，生长素还可改善植物体内的氮素分配。SiobhanA等发现LEC2的异位表达可以促进植物体内生长素的合成。当LEC2被激活，生长素响应基因受诱导表达，相关酶(YUC2和YUC4)合成，其中YUC4可能是LEC2的直接转录靶点，蛋白和油体随之开始积累。然而，目前关于LEC2转录因子的异位表达能否提高植物对低氮胁迫的耐受性尚不清楚。烟草是常见的模式植物之一，对氮素营养需求大，一旦缺乏将导致其生长受抑制，烟叶产量下降，而过量又会延长其生育期，降低烟叶品质。研究低氮条件下烟草的胁迫响应机制，不仅为提高作物营养利用效率提供理论指导，还对发展节约型农业模式具有重要意义。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于研究如何提高植物的低氮胁迫耐受性，进而揭示了LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用；再此基础上利用基因工程技术提供一种提高植物低氮胁迫耐受性的方法，该方法是通过将LEC2基因在植物体内异位表达，从而使转基因植株与野生型相比叶片衰老缓慢，且叶绿素含量高于野生型，表现出低氮胁迫耐受性。本研究构建了35S启动子驱动的AtLEC2过表达载体，遗传转化烟草幼苗，通过分析T1代植株在缺氮培养条件下的表型变化，结果表明过表达AtLEC2转基因烟草植株并未出现类似野生型的叶片黄化现象，显示出一定的缺氮胁迫耐受性。本专利技术请求保护LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用，所述LEC2基因包括与SEQIDNO：01的核苷酸序列同源性达到90％以上的基因，或与SEQIDNO：02的氨基酸序列同源性达到95％以上的基因。进一步的，所述应用是通过在植物体内异位或异源表达LEC2基因以提高植物的低氮胁迫耐受性。更进一步的，所述植物为烟草。更进一步的，所述LEC2基因来自拟南芥。本专利技术还提供一种提高植物低氮胁迫耐受性的方法，包括：(1)构建含有LEC2基因的重组植物表达载体；(2)将构建的重组植物表达载体转化到植物组织或细胞中；(3)培育筛选得到低氮胁迫耐受性增强的转基因植株。进一步的，所述重组植物表达载体的构建方法为：首先提取拟南芥种子RNA，反转录形成cDNA，以cDNA为模板，扩增LEC2基因片段；然后将LEC2基因片段插入到双元载体pBI121中，构建重组植物表达载体pBI121-LEC2。本专利技术的有益效果：本专利技术首次开发了含有LEC2基因的转录基因在提高植物低氮胁迫耐受性方面的应用，通过在植物组织或细胞内异位表达，增加了植物对于低氮胁迫的耐受性，通过转基因方法将该基因转入到植物体内，培育筛选出具有高低氮胁迫耐受性的转基因植株，从而降低氮素肥料的施用量，不但节约资源，还能减少土壤中过量氮素残留对环境产生的危害，符合国家政策需求，是民之所向。尤其是获取高低氮胁迫耐受性的烟草，提高烟株营养利用效率，也对发展节约型农业模式具有重要意义。附图说明图1是pBI121-35SMCS的载体示意图；图2是pBI121-35S-LEC2载体示意图；图3是用BamHI和XhoI酶切pBI121-35S-LEC2；其中，1、2：BamHI和XhoI酶切；图4是用SacI和XbaI酶切pBI121-35S-LEC2；其中，1、2：SacI和XbaI酶切；M：1kbDNAladder；图5是转基因烟草的获得过程示意图；图6是转基因烟草T0阳性植株的筛选结果，1-7表示转基因烟草的不同株系；图7是转基因烟草T1阳性植株的筛选结果；图8是缺氮21天时野生型与T1代含有LEC2基因的转基因烟草的表型观察；其中，左侧是野生型烟草；右侧是T1代含有LEC2基因的转基因烟草；图9是低氮处理不同时期时黄色叶片百分比对比图；图10是T1转基因烟草低氮条件下叶绿素含量的分析图。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术做进一步的解释说明。实施例11、植物材料与菌种本试验所用的植物材料是烟草K326，是一种大田栽培品种，由河南农业大学烟草学院提供。拟南芥为哥伦比亚型。农杆菌菌株为改造后的GV3101。2、试剂配置各试剂母液浓度：Ca(NO3)2·4H2O142.8mM，MgSO4·7H2O1M，CaCl2608mM，K2HPO4400mM，FeNa2EDTA17.85mM，K2CO3806Mm，H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O1.81g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，CuSO4·5H2O0.051g/L，H2MoO40.081g/L。3、载体pBI121-35SMCS的构建在pBI121-GUS中插入启动子35S和多克隆位点，构建重组载体pBI121-35SMCS。具体步骤为：以质粒pBI121-GUS为模板，用引物ZZF47和ZZF48进行PCR扩增，获得35Spromoter。然后以35Spromoter为模板，分别用3对引物ZZF47和ZZF49，ZZF47和ZZF50，ZZF47和ZZF51依次对其纯化回收产物进行PCR扩增，最终获得DNA片段35S-MCS。其中多克隆位点包括BamHI，XmaI，SmaI，XhoI和SacI。通过酶切位点HindIII和SacI将DNA片段35SMCS克隆到载体pBI121-GUS，从而获得新的双元载体pBI121-35SMCS，如图1所示。相关引物序列如下表1所示。分别用ClaI和EcoRI，HindIII和SacI对pBI121-35SMCS载体进行双酶切，将酶切产物进行凝胶电泳，酶切的片段分别为1595bp和11313bp，915bp和11993bp，正确。且经测序验证，序列正确。4、35S-AtLEC2过表达载体构建用植物总RNA试剂盒(产品编号：5111050，杭州新景)，提取拟南芥种子RNA。用反转录试剂盒(产品编号：6210A，TaKaRa)反转录形成cDNA。以cDNA为模板，用LEC2特异性引物(FP：AAATGGATAACTTCTTACCCTTTC；RP：TCACCACCACTCAAAGTCGTTAAAG)进行PCR扩增，获得LEC2片段，核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。然后以纯化回收产物为模板，分别用引物(LEC2FP-XbaI)和(LEC2RP-SacI)进行PCR扩增，分别在5’末端和3’末端加上单酶切位点，最终获得带本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用，其特征在于：所述LEC2基因包括与SEQ ID NO：01的核苷酸序列同源性达到90%以上的基因，或与SEQ ID NO：02的氨基酸序列同源性达到95%以上的基因。
【技术特征摘要】
1.LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用，其特征在于：所述LEC2基因包括与SEQIDNO：01的核苷酸序列同源性达到90%以上的基因，或与SEQIDNO：02的氨基酸序列同源性达到95%以上的基因。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：通过在植物体内异位或异源表达LEC2基因以提高植物的低氮胁迫耐受性。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草。4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述LEC2基因来自拟南芥。5.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛金曼，陈钰佩，牛蕾蕾，雷洁，郑志富，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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