一种培养贴壁细胞用无血清培养基及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种培养贴壁细胞用无血清培养基及其应用，属于细胞培养基领域。通过以DMEM高糖培养基和减血清培养基为基础培养基，同时基础培养基中含有血清替代物、复合氨基酸、青霉素和链霉素。本发明专利技术提供的无血清培养基没有动物源物质细胞培养基，因此所述无血清培养基不依赖于动物血清的使用，且成分确定，提供了一种血清培养基的替代方案，有利于市场推广。所述的无血清培养基在培养贴壁细胞中的应用。本发明专利技术提供的无血清培养基不仅可以维持贴壁培养的肿瘤细胞和正常细胞系的自我更新，可实现长时间培养和传代而不增加细胞凋亡比例。

A serum-free medium for culturing adherent cells and its application

The invention provides a serum-free medium for culturing adherent cells and its application, belonging to the field of cell culture medium. DMEM high glucose medium and hypoglycemic medium were used as the basic medium, and the basic medium contained serum substitutes, compound amino acids, penicillin and streptomycin. The serum-free medium provided by the invention has no animal-derived material cell culture medium, so the serum-free medium does not depend on the use of animal serum, and the composition is determined. The serum-free medium provides an alternative scheme for serum culture medium, which is favorable for market promotion. The application of the serum-free medium in culture adherent cells. The serum-free medium provided by the invention can not only maintain the self-renewal of the adherent cultured tumor cells and normal cell lines, but also realize long-term culture and passage without increasing the proportion of apoptosis.

【技术实现步骤摘要】
一种培养贴壁细胞用无血清培养基及其应用
本专利技术属于细胞培养基领域，具体涉及一种培养贴壁细胞用无血清培养基及其应用。
技术介绍
细胞培养是细胞生物学和肿瘤相关研究中的最常用的基本技术。细胞体外培养时，培养基为细胞生长、分裂和增殖提供了必要的外环境，包括模拟生理酸碱浓度的缓冲液、基础代谢所需物质和部分营养因子。根据细胞特性，细胞培养方式通常分为悬浮培养和贴壁培养方式，除干细胞、淋巴细胞等血液系统细胞常用悬浮培养方式外，体内大多数细胞包括正常细胞和肿瘤细胞由于依赖贴壁而采用贴壁培养方式。贴壁细胞培养时，除需要提供细胞赖以贴壁生长的培养介质，如TC处理的培养皿底、甚至是细胞外基质包被的培养皿，还需要在培养液中添加血清辅助细胞贴壁并提供细胞生长所需的各种营养。通常的贴壁细胞培养基方案为液基础培养基(如：DMEM、RPMI1640和DMEM/F12)，补充5～20％的胎牛/新生牛血清。血清的优点是供应充足，价格便宜。但是缺点也显而易见：首先存在传播传染病的风险及异种蛋白导致的过敏症；其次血清成分复杂，有一部分组成尚不清楚，血清的质量、各种因子的组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件、饲养条件、生产工艺和质量把控不同而异，导致不同批次间产品的成分差异较大；再次由于血清营养物质丰富，含有各种生长因子和细胞因子，会掩盖实验条件对细胞的作用，如细胞增殖、分化、侵袭、迁移和趋化等实验；最后肿瘤研究中常常用到各种药物、激动剂、抑制剂等干预方式，血清的存在很大程度上会干扰研究者对这些干预措施产生的效果的观察和评估，甚至有些干预措施需要在无血清条件下进行，而肿瘤细胞无法长时间耐受无血清条件。综上所述，需要寻找一种能够替代血清且成分确切、组分含量能稳定控制，并适宜肿瘤细胞生长的培养基，提高实验结果的可重复性，对于肿瘤研究具有重要价值。目前在细胞培养中有多种血清替代方案，如Gibco的KnockOutTMSerumReplacement和依科赛生物科技有限公司获得授权专利(CB103555660B)的“一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用”，均是针对干细胞的无血清替代方案。干细胞培养根据培养方法不同主要有两种培养方式，贴壁培养法和悬浮培养法。贴壁培养法以前多采用含血清培养基并将干细胞培养于饲养层细胞上，上述血清替代物可以使干细胞维持未分化和全能状态。而悬浮培养法采用无血清基础培养基，添加EGF、bFGF等生长因子。对于依赖贴壁生长的肿瘤细胞和正常细胞体，干细胞无血清培养方法不能使细胞正常贴壁并生长。而CN102352343A和CN104830765A所公开的培养基方案和胎牛血清替代物均是用于淋巴细胞培养，淋巴细胞采用悬浮培养法，无法用于贴壁培养的肿瘤细胞。因此，在上述培养基方案中，肿瘤细胞无法正常贴壁，也无法正常增殖，培养一定时间后凋亡率显著增高直至全部死亡，影响实验研究的正常进行。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种培养贴壁细胞用无血清培养基及其应用，培养基不仅可以维持贴壁培养的肿瘤细胞和正常细胞系的自我更新，还可以长时间培养和传代而不增加细胞凋亡比例。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种培养贴壁细胞用无血清培养基，以DMEM高糖培养基和减血清培养基为基础培养基；每升基础培养基还含有1.5～2.5ml的血清替代物，63.68～95.5mg的复合氨基酸，0.9～1.1×105U青霉素和0.9～1.1×105mg的链霉素；所述DMEM高糖培养基和减血清培养基的体积比为50～54:46～50；所述复合氨基酸包括以下重量份的氨基酸：优选的，所述复合氨基酸包括以下工作浓度的氨基酸：优选的，所述血清替代物为GibcoB-27。优选的，所述减血清培养基为GibcoOpti-MEM。优选的，所述DMEM高糖培养基包括以下质量浓度的组分：优选的，每升基础培养基含有1.5～2.5ml的血清替代物，76.8mg的复合氨基酸，1×105U青霉素和1×105mg的链霉素。优选的，所述DMEM高糖培养基和减血清培养基的体积比为52:48。本专利技术提供了所述的无血清培养基在培养贴壁细胞中的应用。优选的，所述贴壁细胞包括肿瘤细胞和健康贴壁生长细胞系。优选的，所述肿瘤细胞包括人神经胶质瘤细胞、人肺癌细胞、人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞或人胶质母细胞瘤细胞。优选的，所述培养的时间为1～10d。本专利技术提供了一种用于培养贴壁细胞用无血清培养基，通过以DMEM高糖培养基和减血清培养基为基础培养基，同时每升基础培养基中含有1.5～2.5ml的血清替代物，63.68～95.5mg的复合氨基酸，0.9～1.1×105U青霉素和0.9～1.1×105mg的链霉素；所述DMEM高糖培养基和减血清培养基的体积比为50～54：46～50。本专利技术提供的无血清培养基不含动物源物质。所述无血清培养基不依赖于动物血清的使用，且成分确定，提供了一种血清培养基的替代方案，有利于市场推广。同时，人和动物大多数成体细胞和肿瘤细胞都有贴壁生长特性，在生物医学研究中细胞培养是常用方法，这些细胞的培养时需要在培养液中添加血清以帮助细胞贴壁并以贴壁方式生长，如果没有血清提供贴壁辅助，这些细胞会由于不能正常贴壁还逐渐死亡。本专利技术所述的培养液方案中，DMEM为基础培养基，提供细胞生长的基础生理环境，OPTI-MEM减血清培养基的特点是可以降低血清依赖细胞的血清使用浓度，它不仅提供了细胞生长的基础环境，还有加了次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、微量元素和生长因子，这些成分加上添加的非必需氨基酸、B27血清替代物很好的起到替代血清的维持细胞正常贴壁和促细胞生长、增殖扩增的作用。青/链霉素是抗生素，在细胞培养过程中抑制细菌污染和繁殖。本专利技术提供了所述的无血清培养基在培养贴壁细胞中的应用。本专利技术提供的无血清培养基不仅可以维持贴壁培养的肿瘤细胞和正常细胞系的自我更新，可实现长时间培养和传代而不增加细胞凋亡比例。CCK8结果显示，相较于血清培养基组，各种常用肿瘤细胞系和正常细胞系(HREC)在无血清组细胞增殖能力相对减弱(P<0.05)，但在SW480、U87、U251细胞中未见差异；虽然相对有血清培养基细胞增殖能力相对减弱，但所有细胞均显示正常生长和不断增殖的趋势；同时细胞克隆实验结果表明，长时间培养后无血清培养基组细胞能正常形成克隆，克隆数较血清组减少，克隆团块较小，与CCK8细胞增殖结果一致，表明虽然无血清培养较有血清培养基细胞增殖能力减弱，但不干扰细胞的正常生长，长时间培养也能保持持续生长、增殖和克隆扩增能力；此外，流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示血清和无血清培养基组培养48h后细胞凋亡率无明显差异，P>0.05，表明无血清培养方案虽然较有血清培养方案会使细胞增殖能力减弱，但不会诱导无血清诱导的细胞凋亡现象。附图说明图1为血清培养基与无血清培养基中A172细胞增殖的比较结果；图2为血清培养基与无血清培养基中A549细胞增殖的比较结果；图3为血清培养基与无血清培养基中Hela细胞增殖的比较结果；图4为血清培养基与无血清培养基中SW480细胞增殖的比较结果；图5为血清培养基与无血清培养基中U87细胞增殖的比较结果；图6为血清培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养贴壁细胞用无血清培养基，其特征在于，以DMEM高糖培养基和减血清培养基为基础培养基；每升基础培养基还含有1.5～2.5ml的血清替代物，63.68～95.5mg的复合氨基酸，0.9～1.1×105U青霉素和0.9～1.1×105mg的链霉素；所述血清替代物为Gibco B‑27；所述DMEM高糖培养基和减血清培养基的体积比为50～54：46～50；所述复合氨基酸包括以下重量份的氨基酸：

【技术特征摘要】
1.一种培养贴壁细胞用无血清培养基，其特征在于，以DMEM高糖培养基和减血清培养基为基础培养基；每升基础培养基还含有1.5～2.5ml的血清替代物，63.68～95.5mg的复合氨基酸，0.9～1.1×105U青霉素和0.9～1.1×105mg的链霉素；所述血清替代物为GibcoB-27；所述DMEM高糖培养基和减血清培养基的体积比为50～54：46～50；所述复合氨基酸包括以下重量份的氨基酸：2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，每升基础培养基含有2ml的血清替代物，76.8mg的复合氨基酸，1×105U青霉素和1×105mg的链霉素。3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述DMEM高糖培养基和减血清培养基的体积比为52:48。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹健，纪丽，邹奕苏，殷莹，汪京京，龚玲丽，胡亚玲，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32