The invention uses CRISPER/Cas9 system to mediate goat VEGF gene site-directed integration, which is based on goat FGF5 gene sequence, constructs Cas9_gRNA expression vector and VEGF targeting vector based on CRISPER/Cas9 system, and then transfers optimized Cas9_gRNA expression vector and VEGF targeting vector to goat fetal fibroblasts. The VEGF gene was obtained at the FGF5 site. The target vector constructed by the invention based on CRISPER/Cas9 system provides a simple, fast and safe way for goat VEGF gene targeted integration and FGF5 gene targeted knockout. This method does not involve any screening marker genes in the process of cell line screening, which greatly improves the safety of transgenic animals, and is of great value to the genetic breeding of goats and the study of gene function.
【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法
本专利技术涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及CRISPR/Cas9技术介导的山羊VEGF基因定点整合及FGF5基因敲除的方法。
技术介绍
成簇短间隔回文重复系统（ClusteredRegulatoryInterspacedShortPalindromicRepeat，CRISPR）作为第三代基因编辑技术，因其史无前例的特异性，有效性和多功能性而闻名。其来源于原核生物的获得性免疫系统，提供获得性免疫能力用来抵抗外来基因原件如噬菌体等的入侵，广泛存在于古生菌和原核生物中。CRISPR/Cas9系统近来发展成为可以对真核生物基因组进行特异性编辑的有效工具。与传统的锌指核酸酶（znicfingernuclease，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALENs）相比，CRISPR/Cas9系统有着更高的基因编辑效率及更低的制作成本，可以灵活的应用于不同的核苷酸序列，是更为强力的基因编辑工具。CRISPR/...
【技术保护点】
1.CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法，其特征在于，其是根据山羊的FGF5基因序列，构建基于CRISPER/Cas9系统的Cas9‑gRNA表达载体和VEGF打靶载体，然后将优化后的然后将优化后的Cas9‑gRNA表达载体及VEGF打靶载体共同转染至山羊胎儿成纤维细胞中，获得VEGF基因在FGF5位点定点整合的细胞株。
【技术特征摘要】
1.CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法，其特征在于，其是根据山羊的FGF5基因序列，构建基于CRISPER/Cas9系统的Cas9-gRNA表达载体和VEGF打靶载体，然后将优化后的然后将优化后的Cas9-gRNA表达载体及VEGF打靶载体共同转染至山羊胎儿成纤维细胞中，获得VEGF基因在FGF5位点定点整合的细胞株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，靶位点在FGF5基因的第1外显子上。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶序列为5′-agcccctcggggcgccggac-3′。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：呼啸，刘东军，郝斐，高源，梁浩，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15
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