本发明专利技术提供了一种猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其包括pX458载体以及连接在pX458载体上的靶向猪MC1R基因的sgRNA，靶向猪MC1R基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术可以在猪的基因组内实现精确的基因修饰，同时不引入任何外源DNA序列，保留其肉质优良、口感好等优良性状，有效地避免了传统转基因技术可能产生的生物安全风险。
* Cas9/sgRNA co expression vector of porcine MC1R gene and its construction method and Application
The invention provides a Cas9/sgRNA co expression vector of pig * MC1R gene, which comprises a pX458 carrier and a * * sgRNA targeted to the pig MC1R gene connected to the pX458 vector, and the nucleotide sequence targeting sgRNA of the pig MC1R gene is shown as SEQ ID NO.1 and SEQ. * the invention can achieve precise gene modification in the genome of pigs, and does not introduce any exogenous DNA sequence, retaining its excellent meat quality and good taste. It effectively avoids the biological safety risks of traditional transgenic technology.
【技术实现步骤摘要】
猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体及其构建方法及应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体的构建方法及其应用。
技术介绍
在改变猪种的毛色领域，通常采用的是不同品种间杂交方法，该技术的实施步骤为以一种猪为母本跟另外一种猪为父本进行配种获得杂交子一代，然后与母本进行多次回交固定毛色表型。然而，在改变某一猪种毛色的同时也会改变其肉质和繁殖力等其他经济性状，表型变化结果难以控制。这是因为通过传统的杂交育种技术在改变某一猪种毛色的同时，因引入另一种猪种的基因组，会改变多数基因的表达情况，因此会改变毛色之外的其他重要经济性状。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效定向改变猪毛色的技术方案。为了实现以上目的，本专利技术提供了一种猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其包括pX458载体以及连接在所述pX458载体上的靶向猪MC1R基因的sgRNA，所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。优选地，所述猪为两广小花猪。本专利技术还提供了一种宿主细胞，其包括上述猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体。本专利技术还提供了猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体的构建方法，其包括以下步骤：(1)设计并合成靶向猪MC1R基因的sgRNA，所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；(2)对所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的正负两条寡核苷酸链进行磷酸化和程序性退火处理，使之形成具有BbsⅠ相应的黏性末端的双链DNA短片段；(3)使用BbsⅠ酶切pX458载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒进行回收；(4)使用T4连接酶将步骤(2)得到的双链DNA短片段与步骤(3)得到线性化的pX458载体进行连接，然后将连接产物转化至DH5α细菌感受态细胞中，并涂布到氨苄抗性的LB平板上，最后挑选细菌单克隆，通过测序鉴定靶向猪MC1R基因的sgRNA序列是否正确插入到pX458载体中，挑选正确的克隆摇菌培养，提取靶向猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体。在该构建方法中，优选地，所述猪为两广小花猪。本专利技术还提供了上述猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体用于改变猪毛色的应用。本专利技术还提供了上述猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体在制备用于改变猪毛色的试剂方面的应用。本专利技术通过构建靶向猪MC1R基因的CRISPR/Cas9表达载体，转染两广小花猪新生仔猪的肾细胞，提取基因组T7E1酶切分析和PCR产物TA克隆测序分析，检测了CRISPR/Cas9对MC1R的编辑活性。在验证其编辑效率达45％以上后，通过流式分选技术富集到EGFP阳性细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术构建基因编辑克隆胚胎，并进一步通过胚胎移手术将其植入代孕大白母猪的输卵管内，经过正常妊娠后获得白毛色的MC1R编辑两广小花猪。本专利技术应用CRISPR/Cas9技术编辑两广小花猪的MC1R基因，可以在两广小花猪的基因组内实现精确的基因修饰，同时不引入任何外源DNA序列，保持了两广小花猪基因组的“纯度”，保留其肉质优良、口感好等优良性状，有效地避免了传统转基因技术可能产生的生物安全风险。此外，本专利技术采用基因编辑定向方式改变中国地方猪种的毛色性状，从而避免了传统杂交育种过程中在改变毛色性状的同时，引入外来猪种的血缘，影响了中国地方猪种原有的优良肉质和抗逆性强等优秀的性状。这对于培育出满足不同的市场需求的新毛色两广小花猪具有重要的育种意义。附图说明图1为Cas9/sgRNA共表达载体pX458的图谱示意图。图2示出了T7E1和TA克隆测序分析MC1R-sgRNA-1在PK细胞中的基因编辑效率。图3示出了TA克隆测序检测MC1R-sgRNA-1在克隆胚胎中的基因编辑效率。图4为野生型和MC1R基因编辑型两广小花猪的毛色对比结果。图5为野生型和MC1R基因编辑型两广小花猪的肤色对比结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的应用范围。如未特别指出，实施例中涉及但未详细描述细节参数的操作为本领域技术人员所熟知的。实施例1.MC1R基因靶位点选择从NCBI下载中国地方猪的MC1R基因全长序列，利用sgRNA在线设计软件(http://crispr.mit.edu/)进行分析，设计2条靶向猪MC1R基因的sgRNA，该sgRNA的具体序列见以下表1以及序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。表1靶向猪MC1R基因sgRNA序列信息注：PAM(protospacer-adjacentmotif)指sgRNA结合基序。2.靶向猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体构建pX458载体可同时表达sgRNA、密码子经人源性优化的Cas9蛋白、以及报告基因EGFP，图谱如图所示(图1)。根据以上设计的2条sgRNA序列，合成相应的寡核苷酸正负单链，每条单链上添加有BbsⅠ相应的黏性末端。首先使用BbsⅠ酶切1μgpX458载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒进行回收。同时，对sgRNA的正负两条寡核苷酸链进行磷酸化和程序性退火处理，使之形成具有黏性末端的双链DNA短片段，使用T4连接酶将其与线性化的pX458载体进行连接，然后将连接产物转化至DH5α细菌感受态细胞中，并涂布到氨苄抗性的LB平板上，最后挑选细菌单克隆，通过测序鉴定sgRNA序列是否正确插入到pX458载体中，挑选正确的克隆摇菌培养，提取靶向猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体。3.两广小花猪肾细胞培养与转染两广小花猪肾细胞(porcinekidneycell，PKcell)从新生仔猪的肾脏中分离建立。PK细胞在含有20％胎牛血清和双抗(100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)的DMEM培养基中生长。细胞培养1-2天后更换一次培养基。PK细胞生长至80％左右的汇合度时，先用PBS洗涤两遍，然后用胰酶消化2min，随后加入血清终止消化，将消化后的细胞收集至15mL的离心管进行离心，弃上清后再用PBS洗涤一遍进行第二次离心。离心后弃上清，然后用适量BufferR溶液重悬细胞，使细胞密度达到1.0×107细胞/mL，使用NeonTM转染系统对PK细胞进行电击转染。转染条件为：电压：1600V，width：40ms，脉冲次数：3。细胞转染后24h更换培养基，添加双抗，在5％的CO2、37℃条件下进行培养。3d后进行流式分析、分选或者收取细胞提取DNA进行后续实验。4.T7E1实验使用T7E1进行酶切，设计合适的引物如以下表2以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。表2T7E1酶切实验引物T7E1酶(T7核酸内切酶I)可以用来检测CRISPR/Cas9介导的基因突变，筛选阳性克隆。PK细胞在转染后3d，或者是分选后再培养一周之后，使用组织/细胞提取试剂盒提取细胞基因组，通过PCR扩增出包含sgRNA识别位点的MC1R基因片段，采用AxygenPCR清洁试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物先在高温下变性，然后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其特征在于包括pX458载体以及连接在所述pX458载体上的靶向猪MC1R基因的sgRNA，所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其特征在于包括pX458载体以及连接在所述pX458载体上的靶向猪MC1R基因的sgRNA，所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的Cas9/sgRNA共表达载体，其特征在于，所述猪为两广小花猪。3.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1或2所述的Cas9/sgRNA共表达载体。4.猪MC1R基因的Cas9/sgRNA共表达载体的构建方法，其包括以下步骤：(1)设计并合成靶向猪MC1R基因的sgRNA，所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；(2)对所述靶向猪MC1R基因的sgRNA的正负两条寡核苷酸链进行磷酸化和程序性退火处理，使之形成...
【专利技术属性】
技术研发人员：何祖勇，陈瑶生，刘小红，刘红波，石翾，秦珂，刘小凤，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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