用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了用于检测肿瘤标志物miRNA‑141的SERS生物传感器的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）将Fe3O4@Au磁性纳米颗粒与捕获探针结合得到捕获单元溶液；（2）将空心金纳米球与引发探针结合制备即得信号单元溶液；（3）将捕获单元、miRNA‑141和信号单元反应结合，磁选分离得到SERS生物传感器，其应用为利用拉曼光谱仪测定SERS信号，测定一系列不同浓度的miRNA‑141对应的SERS信号强度，建立miRNA‑141浓度与SERS信号强度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中miRNA‑141浓度，优点是灵敏度高、特异性强、组装过程简单以及检测速度快。

Preparation and application of SERS biosensor for detecting tumor marker miRNA-141

The invention discloses a preparation method and application of a SERS biosensor for detecting tumor marker microRNA_141, which is characterized by the following steps: (1) combining a Fe3O4@Au magnetic nanoparticle with a capture probe to obtain a capture unit solution; (2) combining a hollow gold nanosphere with an initiation probe to prepare a signal unit solution. (3) The SERS biosensor was obtained by magnetic separation by combining capture unit, microRNA141 and signal unit reaction. The SERS signal intensity was measured by Raman spectroscopy, and the quantitative relationship between the concentration of microRNA141 and the intensity of SERS signal was established. According to this quantitative relationship, the concentration of microRNA141 in unknown samples can be determined. The advantages are high sensitivity, strong specificity, simple assembly process and fast detection speed.

【技术实现步骤摘要】
用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用
本专利技术涉及检测肿瘤标志物miRNA-141的检测方法，尤其是涉及用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
癌症，也称恶性肿瘤，本质上是一种多基因疾病，是由细胞生长增殖机制失常引起的疾病，严重危害人类健康。联合国世界卫生组织下属的国际癌症研究机构预计到2030年将会有1320万人死于癌症，确诊病例将达到2140万人。虽然癌症死亡率高但并非不可治愈，研究表明：癌症早期是治愈癌症的最佳时期，因此实现对肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗，可以有效地预防和治疗癌症。肿瘤标志物的发现使得早期诊断成为可能。肿瘤标志物是在肿瘤的发生和增殖过程中产生、反映肿瘤存在和生长的物质，大量研究表明，不同种类的肿瘤疾病会导致不同种类微小核糖核酸MicroRNA（miRNA）含量的变化。因此，作为一类具有高特异性的肿瘤标志物，miRNA检测对肿瘤疾病的早期诊疗具有重要科学意义和应用前景。表面增强拉曼散射光谱（SERS）是一种重要的光谱检测技术，在生物检测方面体现出了相当大的优势。一方面，粗糙的金属表面作为SERS基底，能够使SERS信号强度大大增加，增强幅度能够达到106～1014，因此SERS可对微量或者痕量目标物进行超灵敏检测；另一方面，与其他方法的标记物相比，SERS标记物具有更简单、更广泛、更尖锐的“指纹”信号和良好的重复性。目前，大量新型纳米材料如空心纳米球、纳米颗粒、纳米线等，也被用作为SERS基底以增强信号强度，其中，空心金纳米球、银纳米颗粒因制备方法简单、具有良好的生物相容性、信号增强能力大等优点，尤为受到关注。生物传感器是以酶、蛋白质、核酸、细胞等生物物质作为敏感元件与待测样品进行接触，并将目标物浓度、物质的量等性质转变为电信号、光信号等可视信号的系统，DNA生物传感器是其中一种，其以DNA为敏感元件，待测定的核酸序列与敏感元件杂交形成双链DNA结构将反应过程的变化转化为能记录的信号，进而推测出待测定的核酸序列的量，近年来，聚合酶链式反应（PCR）、杂交链式反应（HCR）等技术在DNA生物传感器构建方面有不少应用。目前，国内外还没有公开关于用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、组装过程简单以及检测速度快的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）捕获单元制备a.制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0gFeCl3·6H2O和0.2～0.5gFeCl2·4H2O溶于50～100mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；b.制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40～50mLFe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1h，加入0.2～0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌4～5h，加入1～2mL0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h，水清洗至中性，乙醇定容至100mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；c.制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20mL1wt%HAuCl4溶液在60～100kHz的超声频率下混合，搅拌1h后，缓慢加入30～50mL20～30mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3h，水清洗至中性，乙醇定容至20mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；d.制备捕获单元溶液：取50～100µLFe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10min，加入20～50µL1～5µmol/L捕获探针（CP）溶液，用DNA固定液定容至200µL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h，利用Au-S键合作用，捕获探针（CP）自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20µL10～20mmol/L巯基己醇（MCH）溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100µL，即得捕获单元溶液；（2）信号单元制备a.制备金纳米颗粒（GNPs）溶液：取10～20µL四羟甲基氯化磷（THPC）加入到50～60mL6～7mmol/LNaOH溶液中，搅拌5min，加入1.8～2.0mL1wt%HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30min，置于4℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；b.制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2～3mL正硅酸乙酯（TEOS）加入到40～60mL乙醇中，再加入3～4mL水、3～4mL10～20wt%氨水和40～50mL乙醇，混合均匀，室温下反应20h，水清洗，乙醇定容至50mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10mLSiO2纳米颗粒溶液，加入100～120µL3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），混合均匀，80℃下烘箱中反应2h，冷却之后，超声0.5h，离心清洗，用水定容至10mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；c.制备二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液：取100～120µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50～60mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2h，清洗，水定容至20mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液；d.制备空心金纳米球（HGNs）溶液：称取10～15mgK2CO3溶于40～50mL水中，搅拌5min后，逐滴加入0.8～1.0mL1wt%HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3-HAuCl4生长液；取40～50mLK2CO3-HAuCl4生长液，加入0.5～1.0mL二氧化硅/金纳米复合颗粒（SiO2@GNPs）溶液，搅拌5min，加入0.3～0.5mL0.1mol/LH2O2溶液，继续搅拌30min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20mL，得到金纳米壳溶液；取5～6mL金纳米壳溶液，加入2～3µL0.02mol/L氢氟酸（HF），缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20mL，得到空心金纳米球（HGNs）溶液；e.制备信号单元溶液：取300～400µL空心金纳米球（HGNs）溶液，超声10min，加入5～10µL5～10µmol/L引发探针（TP）溶液，用DNA固定液定容至500µL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h后，加入发卡DNA1（H1）和发卡DNA2（H2），37℃下孵育2～3h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500µL，得到HGNs/HCR溶液；取400～500µL的HGNs/HCR溶液，加入5～10µL5～10mmol/LAgNO3溶液，反应20min，Ag+吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入10～20µL10～20mmol/L氢醌溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测肿瘤标志物miRNA‑141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）捕获单元制备a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0 g FeCl3·6H2O和0.2～0.5 g FeCl2·4H2O溶于50～100 mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100 ℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2 h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50 mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40～50 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1 h，加入0.2～0.3 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5 h，加入1～2 mL 0.1～0.5 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h，水清洗至中性，乙醇定容至100 mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20 mL 1wt% HAuCl4溶液在60～100 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入30～50 mL 20～30 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h，水清洗至中性，乙醇定容至20 mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；d. 制备捕获单元溶液：取50～100 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10 min，加入20～50 µL 1～5 µmol/L捕获探针溶液，用DNA固定液定容至200 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h，利用Au‑S键合作用，捕获探针自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20 µL 10～20 mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100 µL，即得捕获单元溶液；（2）信号单元制备a. 制备金纳米颗粒溶液：取10～20 µL四羟甲基氯化磷加入到50～60 mL 6～7 mmol/L NaOH溶液中，搅拌5 min，加入1.8～2.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30 min，置于4 ℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2～3 mL正硅酸乙酯加入到40～60 mL乙醇中，再加入3～4 mL水、3～4 mL 10～20 wt%氨水和40～50 mL乙醇，混合均匀，室温下反应20 h，水清洗，乙醇定容至50 mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入100～120 µL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，混合均匀，80 ℃下烘箱中反应2 h，冷却之后，超声0.5 h，离心清洗，用水定容至10 mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取100～120 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50～60 mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2 h，清洗，水定容至20 mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液；d. 制备空心金纳米球溶液：称取10～15 mg K2CO3溶于40～50 mL水中，搅拌5 min后，逐滴加入0.8～1.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3‑HAuCl4生长液；取40～50 mL K2CO3‑HAuCl4生长液，加入0.5～1.0 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5 min，加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，继续搅拌30 min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20 mL，得到金纳米壳溶液；取5～6 mL金纳米壳溶液，加入2～3 µL 0.02 mol/L氢氟酸，缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20 mL，得到空心金纳米球溶液；e. 制备信号单元溶液：取300～400 µL空心金纳米球溶液，超声10 min，加入5～10 µL 5～10 µmol/L引发探针溶液，用DNA固定液定容至500 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h后，加入发卡DNA 1和发卡DNA 2，37 ℃下孵育2～3 h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500 µL，得到HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL 5～10 mmol/L AgNO3溶液，反应20 min，Ag+吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入10～20 µL 10～20 mmol/L氢醌溶液，反应30 min，吸附的Ag+被还原为银纳米颗粒，缓冲液清洗，定容至500 µL，得到AgNPs@HGNs/HCR溶液；...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）捕获单元制备a.制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0gFeCl3·6H2O和0.2～0.5gFeCl2·4H2O溶于50～100mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；b.制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40～50mLFe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1h，加入0.2～0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5h，加入1～2mL0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h，水清洗至中性，乙醇定容至100mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；c.制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20mL1wt%HAuCl4溶液在60～100kHz的超声频率下混合，搅拌1h后，缓慢加入30～50mL20～30mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3h，水清洗至中性，乙醇定容至20mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；d.制备捕获单元溶液：取50～100µLFe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10min，加入20～50µL1～5µmol/L捕获探针溶液，用DNA固定液定容至200µL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h，利用Au-S键合作用，捕获探针自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20µL10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100µL，即得捕获单元溶液；（2）信号单元制备a.制备金纳米颗粒溶液：取10～20µL四羟甲基氯化磷加入到50～60mL6～7mmol/LNaOH溶液中，搅拌5min，加入1.8～2.0mL1wt%HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30min，置于4℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；b.制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2～3mL正硅酸乙酯加入到40～60mL乙醇中，再加入3～4mL水、3～4mL10～20wt%氨水和40～50mL乙醇，混合均匀，室温下反应20h，水清洗，乙醇定容至50mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10mLSiO2纳米颗粒溶液，加入100～120µL3-氨丙基三乙氧基硅烷，混合均匀，80℃下烘箱中反应2h，冷却之后，超声0.5h，离心清洗，用水定容至10mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；c.制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取100～120µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50～60mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2h，清洗，水定容至20mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液；d.制备空心金纳米球溶液：称取10～15mgK2CO3溶于40～50mL水中，搅拌5min后，逐滴加入0.8～1.0mL1wt%HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3-HAuCl4生长液；取40～50mLK2CO3-HAuCl4生长液，加入0.5～1.0mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5min，加入0.3～0.5mL0.1mol/LH2O2溶液，继续搅拌30min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20mL，得到金纳米壳溶液；取...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢静，郭智勇，贾亚茹，邵慧丽，胡宇芳，王邃，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33