一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法技术

本发明专利技术提供一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，包括以下步骤：1)：将粗肽溶液使用碳酸氢铵水溶液的乙腈体系进行第一次纯化；2)：将上述收集的洗脱液使用硫酸钠/硫酸的乙腈体系进行第二次纯化；3)：将收集的洗脱液先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱进行高效液相转盐；4)：将转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸。本发明专利技术具有以下优点：通过多次纯化以及转盐后加入盐酸进行醋酸根等离子含量控制相结合，使用不同的色谱系统，规模化制备得到的特立帕肽醋酸盐纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％，醋酸根离子含量≤5％，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，总收率大于60％。

Purification and ion control method of a special type of peptide

The invention provides a purification and ion control method for the dipeptide acetate acetate, including the following steps: 1): the first purification of the crude peptide solution using the acetonitrile system in ammonium bicarbonate aqueous solution; 2): the eluant collected above is purified with sodium sulphate / sulfuric acetonitrile system for second times; 3): the elution of the collected eluant will be eluted. The solution was first eluted with acetonitrile in ammonium acetate solution, and then eluted with acetonitrile in acetic acid solution to carry out high performance liquid phase salt; 4) the eluant after salt conversion was decompressed and concentrated into hydrochloric acid. The present invention has the following advantages: by combining multiple purification and adding hydrochloric acid to the plasma content control of acetic acid root, using different chromatographic systems, the purity of the dimethanin acetate is more than 99%, the total of the methionine sulfoxide impurity is less than 0.50% and the maximum unknown single impurity is less than 0.10%. The content of acetate ion is less than 5%, the content of chloride ion is less than 4%, the content of trifluoroacetate and sulfate is less than 0.1%, and the total yield is more than 60%.

【技术实现步骤摘要】
一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法
本专利技术涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及符合USP40质量要求的特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法。
技术介绍
特立帕肽(PTH(1-34))，英文名Teriparatide，为一种长链的多肽药物，其肽序为：H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH特立帕肽为人甲状旁腺素(PTH)的1-34氨基酸片段，由美国EliLilly公司经基因重组技术研发制得，以醋酸盐的形式制成药品，于2002年被美国FDA批准上市。它是第一个被批准用于治疗严重骨质疏松的骨形成促进剂，具有广阔的市场前景。目前涉及到特立帕肽合成的文献和专利较多，涉及分离纯化的较少，特别是本专利技术的利用高压反相色谱进行第一次纯化和第二次纯化以及转盐后加入盐酸进行醋酸根等离子含量控制相结合规模化制备(一批可得成品200克以上)纯度和离子含量均符合USP40中特立帕肽醋酸盐原料药质量要求的更是没有涉及。对于本品的纯化方法，已有专利技术进行公开。中国专利CN106167522A公开了将粗品溶解在30％乙腈水溶液中，以醋酸铵缓冲液纯化，控制pH为4.0～7.0，醋酸/乙腈C18柱转盐，制得醋酸特立帕肽的方法，虽然能得到纯度达到99％以上的醋酸特立帕肽醋酸盐，但未指出单杂含量，同时最终制得的醋酸特立帕肽中醋酸根含量未进行描述。中国专利CN102993293A公开了将硫酸和醋酸混合水溶液用氨水调pH值至5.0～6.0的缓冲液进行纯化，收集95％～99％的样品进行调pH值至5.5～7.0后放至2～8℃降温析出产物，离心收集沉淀后用60％磷酸水溶液后，再用水稀释一倍，上反相柱后转盐，最终制得醋酸特立帕肽。其收率未在专利中体现。转盐前样品用60％磷酸溶解，存在产品不稳定降解、引入新杂质、收率不稳定的风险。最终制得的醋酸特立帕肽中醋酸根含量未进行描述，工艺中使用的其他阴离子的含量也未进行研究。专利CN102731643A公开了一种特立帕肽的纯化方法，采用水溶解粗肽，然后采用0.2％TFA/乙腈为流动相，C18柱分离纯化，0.2％醋酸/乙腈C18柱转盐，总收率20.5～32.2％，同样也未研究最大单杂和醋酸特立帕肽中阴离子的具体含量。为解决现有技术存在的杂质及离子含量不明确的难题，获得符合USP40质量要求的特立帕肽原料药，还需对纯化及转盐方法进行进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特立帕肽醋酸盐的大规模分离纯化和离子控制的工艺方法，纯度高且收率好，冻干后醋酸根的含量≤5％，获得符合USP40质量要求的特立帕肽原料药，达到工业化生产的要求，解决了现有技术中存在的杂质及离子含量不明确的难题为了实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案：一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，包括以下步骤：步骤1)：将粗肽溶液使用色谱柱进行第一次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为碳酸氢铵水溶液，用醋酸或氨水调pH，所述流动相B为乙腈；步骤2)：将上述收集的洗脱液使用色谱柱进行第二次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为硫酸钠水溶液，用硫酸调pH，所述流动相B为乙腈；步骤3)：将步骤2)中收集的洗脱液使用色谱柱进行高效液相转盐，其中先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱；步骤4)：将步骤3)中转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸，使醋酸根的残留量控制在5％以下。作为优选，所述步骤1)中流动相A的pH为7.0～9.5，其碳酸氢铵的浓度为0.01～0.2mol/L。作为进一步优选，所述步骤1)中流动相A的pH为8.0，其碳酸氢铵的浓度为0.1mol/L。作为优选，所述步骤2)中流动相A的pH为2.0～4.0，其硫酸钠的浓度为0.05～0.2mol/L。作为进一步优选，所述步骤2)中流动相A的pH为3.0，其硫酸钠的浓度为0.1mol/L。作为优选，所述步骤4)中调节醋酸根含量所用盐酸的量为1～4N。作为进一步优选，所述步骤4)中调节醋酸根含量所用盐酸的量为3.3N。作为进一步优选，所述步骤4)中将加入1～4当量1N盐酸的目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中进行冷冻干燥，得到的特立帕肽纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的醋酸特立帕肽，醋酸根离子含量≤5％，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，纯化收率为60％。作为优选，所述步骤1)至步骤3)所述色谱柱使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶。作为优选，进一步包括以下步骤：在上述步骤1)之前进行如下的样品处理，将粗肽使用体积比5～10％的乙腈水溶液按照浓度5～20g/L溶解，然后使用0.22～0.45μm的滤膜过滤，收集滤液待用。作为更进一步的优选，一种特立帕肽醋酸盐的大规模分离纯化和离子控制的方法，具体包括以下步骤：步骤1)：以体积比5～10％的乙腈水溶液按照浓度5～20g/L溶解粗肽，使用0.22～0.45μm的滤膜过滤。步骤2)：使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行一次分离纯化：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱，将粗肽溶液以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行梯度纯化，将0.01～0.2mol/L碳酸氢铵水溶液用氨水调pH值7.0～9.5后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：10％～30％洗脱；流速为1000～1400ml/min，检测波长为220nm，分段收集。步骤3)：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱将步骤2中收集的合格溶液中乙腈的比例降至10％以下直接进行第二次纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行梯度洗脱纯化，以摩尔浓度为0.05～0.2mol/L的硫酸钠水溶液用硫酸调pH值2.0～4.0后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：10～30％洗脱；流速为1000～1400ml/min，检测波长为220nm，分段收集。步骤4)：用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶进行高效液相转盐，将步骤3)所得溶液用3～5％的乙腈醋酸铵溶液冲洗20～30min，醋酸铵的浓度为10～100mM，然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，收集特立帕肽溶液，所述醋酸水溶液中醋酸的体积比为0.1～0.2％，乙腈比例为35％以上。步骤5)：将转盐后的洗脱液35℃以下减压浓缩，加入1～4N的盐酸调节冻干后产品中醋酸根离子含量，使醋酸根的残留控制在5％以下，将样品置于冷冻干燥机冻干。本专利技术提供的一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，相对现有技术具有以下优点：通过利用高压反相色谱进行一次纯化和二次纯化控制杂质，以及转盐后加入盐酸进行醋酸根等离子含量控制相结合，多次纯化和转盐过程使用不同的色谱系统，规模化制备(一批可得成品200克以上)纯度和离子含量均符合USP40中质量要求的特立帕肽醋酸盐原料药，得到的特立帕肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1)：将粗肽溶液使用色谱柱进行第一次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为碳酸氢铵水溶液，用醋酸或氨水调pH，所述流动相B为乙腈；步骤2)：将上述收集的洗脱液使用色谱柱进行第二次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为硫酸钠水溶液，用硫酸调pH，所述流动相B为乙腈；步骤3)：将步骤2)中收集的洗脱液使用色谱柱进行高效液相转盐，其中先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱；步骤4)：将步骤3)中转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸，使醋酸根的残留量控制在5％以下。

【技术特征摘要】
1.一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1)：将粗肽溶液使用色谱柱进行第一次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为碳酸氢铵水溶液，用醋酸或氨水调pH，所述流动相B为乙腈；步骤2)：将上述收集的洗脱液使用色谱柱进行第二次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为硫酸钠水溶液，用硫酸调pH，所述流动相B为乙腈；步骤3)：将步骤2)中收集的洗脱液使用色谱柱进行高效液相转盐，其中先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱；步骤4)：将步骤3)中转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸，使醋酸根的残留量控制在5％以下。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中流动相A的pH为7.0～9.5，其碳酸氢铵的浓度为0.01～0.2mol/L。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中流动相A的pH为8.0，其碳酸氢铵的浓度为0.1mol/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中流动相A的pH为2.0～4.0，其硫酸钠的浓度为0.05～0.2mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓锐，孟俊东，刘彬，丁伟伟，汤传根，徐勇刚，陈松，张昊宁，
申请(专利权)人：美药星南京制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32