包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法技术

本发明专利技术涉及包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法，本发明专利技术具有如下的效果，即，作为为了进行LAMP的核酸扩增反应，除了4～6种寡聚核苷酸之外，无需设计额外的寡聚核苷酸，通过对基于与DNA和RNA有关的靶(target)基因的特异性序列的核酸扩增的荧光量进行检测，反应结束后还可进行检测且能够实时检测荧光量的方法并根据靶基因来使报告染料不同，从而在一个试管中使反应结束后或者实时检测荧光量来可同时进行多重检测。

Isothermal-based bifunctional oligonucleotides containing reporting dyes and quenchers for isothermal amplification of nucleic acids and nucleic acid amplification and determination using them

The invention relates to a method of isothermal oligooligodeoxynucleotides containing a reported dye, a quenching agent for isothermal amplification of nucleic acid and a method for the use of nucleic acid amplification and determination. The present invention has the following effect, that is, as a nucleic acid amplification reaction for LAMP, there is no need to be designed in addition to 4~6 oligonucleotides. Additional oligonucleotides, detected by the fluorescence of nucleic acid amplification based on the specific sequence of the target (target) gene related to DNA and RNA, can be detected after the reaction and can detect the fluorescence in real time and make the reported dyestuff according to the target gene, so that the reaction is finished in a test tube. Or real-time fluorescence detection can be carried out at the same time multiple detection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法
本专利技术涉及包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法，更详细地，涉及当进行等温核酸扩增反应时，通过实时荧光检测来在每反应时间通过核酸扩增与否的测定及终点(end-point)步骤中的荧光量检测检测反应产物是否进行核酸扩增反应的基于等温的双功能性寡聚核苷酸的用途和利用其的核酸扩增方法及测定方法。
技术介绍
核酸扩增技术为主要在分子生物学及生命工程领域中使用的技术，为可检测少量的核酸并进行分析的方法。为了进行核酸扩增，使用热稳定酶(thermostableenzyme)来分析DNA/RNA的聚合酶链反应(PCR，Polymerasechainreaction)技术最为广泛使用的方法，为反复进行如下过程的方法：在高温条件下，将双链DNA变性为单链DNA后，降低温度来在单链结合引物(primer)，并利用Taq聚合酶(Taqpolymerase)(热稳定酶)使单链DNA延伸至双链DNA。利用荧光物质的实时PCR方法为在PCR过程中根据荧光的发光强度检测核酸的方法，在PCR反应物中间位置添加利用具有相应的互补序列的寡聚核苷酸在5’末端附着报告染料且在3’末端附着猝灭剂的单链的探针(probe)，通过Taq聚合酶的5’→3’核酸外切酶(exonuclase)活性来进行PCR反应时，单链的探针与互补序列相结合并通过Taq聚合酶的延伸反应来使探针从5’末端水解，使报告染料远离猝灭剂来使荧光发光，从而利用实时PCR设备的荧光检测器来显示荧光量。通过实时PCR设备的荧光检测器来使荧光波长不同，从而可检测出两个以上的靶的同时进行多重检测，因而此技术为在病原体检测及突变检测等诊断领域中经常使用的技术，但具有需要高价的实时PCR设备和熟练的技术人员的缺点。无需高价的实时PCR设备而在等温条件下检测DNA/RNA且在比PCR方法更快的时间内检测核酸的等温扩增法(Isothermalamplificationmethod)正在开发当中。为了RNA扩增利用使用如RNA聚合酶、逆转录酶(reversetranscriptase)、核糖核酸酶H(RnaseH)等酶(enzyme)的转录介导的扩增(TMA，TranscriptionMediatedAmplification)、依赖核酸序列的扩增(NASBA，NucleicAcidSequence-BasedAmplification)方法，链替代扩增(SDA，StrandDisplacementAmplification)为如下的方法：核酸外切酶缺乏DNA聚合酶(exonuclase-deficientDNApolymerase)为了合成双链的核酸而置换(displacement)原来的一个链并利用限制性内切酶(restrictionenzyme)来形成缺口(nick)，反复这种过程来使核酸扩增，与此类似的切口和延伸扩增反应(NEAR，NickingandExtensionAmplificationReaction)为以切口酶(nickingenzyme)代替限制性内切酶来使用的方法。核酸恒温扩增(HDA，Helicase-DependentAmplification)为使用从5’末端和3’末端使双链解链的解螺旋酶(Helicase)的功能的方法，与此类似的重组酶聚合酶扩增(RPA，RecombinasePolymeraseAmplification)为利用使双链解链的重组酶(recombinase)的方法。环介导等温核酸扩增反应(LAMP，Loop-mediatedisothermalamplification)为利用具有4～6个特异性引物(specificprimer)和链置换活性(stranddisplacementactivity)的DNA聚合酶的核酸扩增技术(Patent.No.PCT/JP2000/001919)。在LAMP的测定方法中，通过琼脂糖凝胶电泳分析来确认涂抹图案(smearedpattern)的带(band)，来可分析是否进行特定基因核酸扩增反应，但是当进行琼脂糖凝胶电泳分析时，由于开放反应试管，会成为核酸被污染的根源。因此，为了防止核酸被污染，不开放反应试管也可以进行测定的技术正在开发当中，通常，LAMP中所使用的浊度测定法(Mori.Y.etal.，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2001，289：150-154)中，随着等温核酸扩增反应物的增加，基于焦磷酸镁(Magnesiumpyrophosphate，Mg2P2O7)的白色沉淀物被积累，从而可通过测定400nM的波长的浊度来进行实时检测及终点检测，因此无需开放反应试管也可以确认是否进行核酸扩增。但是存在无法同时进行如辨别两个以上靶(target)等多重检测且由于需要测定的焦磷酸镁的沉淀而测定法的准确度降低的缺点。在LAMP中，用于实时检测是否进行核酸扩增的荧光检测法中，无需开放反应试管而仅测定荧光物质，从而具有消除污染发生并消除因产生沉淀物而使准确度下降的现象的优点。在LAMP中，向反应物中添加如SYBRGreenI等双链特异性嵌入物(Intercalater)并可通过荧光强度随着核酸扩增反应物的增加而增大的现象来进行实时检测。实时PCR扩增反应中所使用的SYBRGreenI中，无法确认核酸扩增产物的序列的特异性，因此，在引物二聚体(primerdimer)中也测定出荧光度，为了辨别非特异性反应，进行实时检测之后，使温度缓慢上升至95℃，并通过测定核酸扩增反应物的解链温度来判断是否进行非特异性反应，从而可确认检测与否，且无法同时进行如辨别两个以上靶等多重检测。用于进行基于LAMP的核酸扩增序列特异性荧光检测的技术已被开发。同化探针(Assimilatingprobe)为使用对核酸扩增序列进行特异性设计的两根探针并利用荧光共振能量转移(FRET，FluorescenceResonanceEnergyTransfer)原理来进行实时检测的方法(Patent.No.PCR/US11/41540)。两根探针中的一根中，报告染料附着于5’末端，另一根中，猝灭剂位于3’末端。LAMP核酸扩增中所使用的寡聚核苷酸为6种，包含多个引物，同化探针将其中的环引物(loopprimer)的一个作为对象来设计在5’末端附着报告染料的一根探针，并设计与其互补的部分序列，来设计在3’末端附着猝灭剂的另一根探针，从而需要合成7种寡聚核苷酸，同化探针在LAMP反应之间使两个探针从高温缓慢降温至低温来合成一对探针并使用于核酸扩增。在LAMP中，当为了进行基因序列特异性实时检测而使用同化探针来进行核酸扩增反应时，在LAMP反应中产生抑制效果，从而导致检测时间和实时检测时间变长。使用于同化探针类似的探针的荧光检测法为以使荧光探针(fluorephore-labeledprimer/probe)和猝灭剂探针(quencher-labeledprobe)具有互补序列的方式设计来使用一对探针的方法(PatentNo.P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡聚核苷酸，其特征在于，以与靶基因的特定序列有关的环介导等温核酸扩增反应用引物中的正向内侧引物或反向内侧引物作为对象，使除了3’末端之外的序列中的部分序列变换为内侧dT序列、内侧dG序列、内侧dC序列、内侧dA序列、内侧dU序列或内侧dR序列，并使报告染料或猝灭剂位于其部位，在规定温度以下，全部或部分序列形成双链，泡沫结构为一个以上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.01 KR 10-2015-0169857;2016.05.17 KR 10-2011.一种寡聚核苷酸，其特征在于，以与靶基因的特定序列有关的环介导等温核酸扩增反应用引物中的正向内侧引物或反向内侧引物作为对象，使除了3’末端之外的序列中的部分序列变换为内侧dT序列、内侧dG序列、内侧dC序列、内侧dA序列、内侧dU序列或内侧dR序列，并使报告染料或猝灭剂位于其部位，在规定温度以下，全部或部分序列形成双链，泡沫结构为一个以上。2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，在上述寡聚核苷酸中，报告染料与猝灭剂之间的间距为21～33mer以内。3.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸单独使用或并用正向内侧探针和反向内侧探针。4.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸的报告染料为FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3及CY5中的一种或者具有450～685nm的发光波长范围的染料。5.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸的猝灭剂为TAMRA、DABCYL、黑洞猝灭剂1或黑洞猝灭剂2或者具有500～705nm的吸光波长范围的猝灭剂。6.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸具有1个至4个泡沫结构。7.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，在上述寡聚核苷酸中，双链解链成单链的解链温度为30～70℃。8.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸为序列号5至序列号8及序列号15至序列号16中所记载的寡聚核苷酸中的一种。9.一种执行环介导等温核酸扩增反应或逆转录-环介导等温核酸扩增反应的方法，其特征在于，在等温条件下，使用权利要求1所述的寡聚核苷酸来进行实时核酸扩增荧光检测。10.一种执行环介导...

【专利技术属性】
技术研发人员：元裕德，朴海准，成孝珍，林美爱，李善永，
申请(专利权)人：SD生物传感器株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR