本发明专利技术公开了一种用于鉴别犬细小病毒(CPV)和猫细小病毒(FPV)的HRM引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用。所述的引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。此外，本发明专利技术还提出了一种含有所述的引物组的HRM分析试剂盒。实验证明，使用该试剂盒检测FPV和CPV具有良好的敏感性和特异性，并且与病毒分离、DNA序列测定等试验进行比较，具有很高的符合率，相对特异性和敏感性。本发明专利技术的提出为犬细小病毒(CPV)和猫细小病毒(FPV)病的防治提供了有效技术手段。
A HRM primer group for identifying FPV and CPV, kit containing the primer set and its application
The invention discloses a HRM primer group for distinguishing canine parvovirus (CPV) from cat parvovirus (FPV), a kit containing the primer group and its application. The primer group is composed of upstream primers and downstream primers. The nucleotide sequence of the upstream primers, as shown by SEQ ID NO.1, is shown by the nucleotide sequence of the downstream primers, such as SEQ ID NO.2. In addition, the invention also provides a HRM analysis kit containing the primer group. Experiments show that the detection of FPV and CPV with this kit has good sensitivity and specificity, and compared with virus isolation and DNA sequencing test, it has high coincidence rate, relative specificity and sensitivity. The invention provides an effective technical means for the prevention and treatment of canine parvovirus (CPV) and cat parvovirus (FPV) diseases.
【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别FPV和CPV的HRM引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于病毒检测引物，含有该引物的试剂盒及其应用，特别涉及一种用于鉴别FPV和CPV的HRM引物，含有该引物的试剂盒及其应用。本专利技术属于病毒检测及诊断
技术介绍
细小病毒(Parvoviridae)是单股、线性DNA病毒，平均基因组大小为5000nt。根据国际病毒分类委员会2016年最新划分，细小病毒被分为可以感染哺乳动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)和猫细小病毒(Felineparvovirus，FPV)属于细小病毒亚科、犬细小病毒属成员。CPV和FPV是家养犬、猫以及野生肉食性动物的主要传染性病原体，基因组相似性为98％以上。上个世纪七十年代第一次从患肠炎犬粪便中分离得到CPV，随后迅速在全世界传播。原始的CPV-2型持续进化，逐渐被新的亚型(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c)所取代。研究报道，CPV是FPV的宿主迁移毒株，是适应新的宿主的结果。CPV比FPV有更快的变异速率，它们分别以每年1.7×10-4和9.4×10-5个单核酸位点变化的速率变异。最近，在越南和中国台湾报道有80％的患病猫都感染CPV，与此相比在美国的收容所内收养的猫和犬猫混合饲养的收容所的猫体内发现CPV感染率是32.5％和33.9％。除此之外，BattilaniM等人报道一只猫同时被CPV和FPV感染的病例。然而，现在除了DNA测序外，CPV和FPV分型诊断的方法只有利用单克隆抗体的血凝抑制试验进行区分。因此一个新的诊断方法对于细小病毒感染后的及时治疗是迫在眉睫的。随着饱和荧光染料的出现，qPCR仪能收集更小范围的荧光变化，并且数据可以利用软件直接分析，高分辨率溶解曲线(HRM)方法正在成为一个快速，有效检测临床样品的新的方法。研究表明HRM已经用于CPV不同亚型的成功鉴别上。因此，本专利技术的目的在于建立一个能减少时间消耗，容易操作，数据自动分析，同时诊断和区分CPV感染和FPV感染的高分辨率溶解曲线方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于鉴别FPV和CPV的HRM引物组；本专利技术的目的之二是提供一种用于鉴别FPV和CPV的HRM分析试剂盒；本专利技术的目的之三是建立一种用于诊断和区分CPV感染和FPV感染的高分辨率溶解曲线方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术专利技术人在GenBank上下载所有犬细小病毒与猫细小病毒全基因组序列，通过MEGA7比对分析，寻找存在稳定的碱基差异基因片段(参考毒株：CPVLaika-1993，登录号：JN033694.1)，设计区分CPV与FPV的一对qPCR引物组(F2/R2)，所述的引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，本专利技术还提出了所述的引物组在制备检测或鉴别猫细小病毒和犬细小病毒感染的试剂中的用途。更进一步的，本专利技术还提出了一种用于鉴别猫细小病毒(FPV)和犬细小病毒(CPV)的HRM分析试剂盒，所述的试剂盒包括本专利技术所述的引物组。其中，优选的，所述的试剂盒还包括含有饱和荧光染料的PCR反应液、阳性标准质粒以及无菌水。其中，优选的，所述的阳性标准质粒按照以下方法制备得到：分别提取猫细小病毒和犬细小病毒DNA，以提取的DNA为模板，以SEQIDNO.3以及SEQIDNO.4所示的序列为引物，进行PCR扩增；PCR产物经纯化后与载体连接，即得阳性标准质粒。其中，优选的，所述的载体为pEASY-T5zero。使用本专利技术所述的试剂盒检测或鉴别猫细小病毒和犬细小病毒感染时，按照以下步骤进行：(1)提取待测样本的总DNA(2)PCR-HRM检测以步骤(2)得到的DNA为模板，使用权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR体系为：PCR-HRM反应程序为：50℃2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，58℃退火40s，循环35次；95℃变性15s，60℃1min到95℃15s以0.025℃/s的溶解速率进行溶解曲线分析。相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过比对CPV和FPV的核酸序列，找出保守的差异位点，设计HRM引物，进行real-timePCR扩增，利用AppliedHighResolutionMeltSoftwarev3.1软件进行数据分析处理，最终建立了用于检测或鉴别猫细小病毒和犬细小病毒的HRM方法。实验证明，该方法具有良好的敏感性和特异性，并且与病毒分离、DNA序列测定等试验进行比对比较，结果发现，HRM方法与DNA测序相比，符合率，相对特异性和敏感性分别为96.25％，91.43％，100％；HRM方法与病毒分离试验相比，符合率，相对特异性和敏感性分别为85％，72.72％，100％。本专利技术的提出为犬细小病毒(CPV)和猫细小病毒(FPV)病的防治提供了有效技术手段。附图说明图1为阳性质粒的鉴定结果；M,DL2000DNAMarker；1,阴性对照；2,pEASY-FPV-H；3，pEASY-CPV-2a，4，阳性对照；图2为本专利技术HRM方法的分析结果；图3为本专利技术HRM方法的特异性试验结果；图4为本专利技术HRM方法的敏感性试验结果。其中图4A为校准溶解曲线；图4B、4C分别为CPV和FPV扩增标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例和附图来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1引物设计在GenBank上下载所有犬细小病毒与猫细小病毒全基因组序列，通过MEGA7比对分析，寻找存在稳定的碱基差异基因片段(参考毒株：CPVLaika-1993，登录号：JN033694.1)，设计区分CPV与FPV的一对qPCR引物(F2/R2)。并设计一对引物(F1/R1)扩增包括qPCR扩增片段在内的基因片段构建CPV与FPV标准质粒，引物序列如表1所示。表1引物序列实施例2高分辨率溶解曲线(HRM)方法的建立1、标准质粒的构建分别取200ulCPV病毒原液和FPV病毒原液，提取病毒DNA。操作步骤按TAKARA的MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0的操作说明进行。以试剂盒提取的DNA为模板，以F1/R1(表1)为引物，参照TaqTM(ExTaqTMVersion2.0plusdye)(Takara,RR902A)操作说明进行PCR扩增，PCR体系(50ul)如表2所示。表2PCR体系(50ul)预扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min；循环35次；72℃终延伸10min。用稀释好的缓冲液(1×TAE)配制3％凝胶。取5ulPCR产物加入凝胶孔中，电泳观察结果。剩余PCR产物参照PCRPurficationKit使用说明进行纯化。将纯化后的DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴别猫细小病毒(FPV)和犬细小病毒(CPV)的HRM引物组，其特征在于，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别猫细小病毒(FPV)和犬细小病毒(CPV)的HRM引物组，其特征在于，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的引物组在制备检测或鉴别猫细小病毒和犬细小病毒感染的试剂中的用途。3.一种用于鉴别猫细小病毒(FPV)和犬细小病毒(CPV)的HRM分析试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物组。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括含有饱和荧光染料的PCR反应液、阳性标准质粒以及无菌水。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性标准质粒按照以下方法制备得到：分别提取猫细小病毒和犬细小病毒DNA，以提取的DNA为模...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建科，程悦宁，孙亚茹，程世鹏，林鹏，易立，仝明薇，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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