一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测用引物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测用试剂盒，同时公开了该试剂盒的检测方法。该方法包括第一步使用随机引物进行反转录，第二步再在一次PCR反应中检测14种高危型HPV E6/E7mRNA和内参基因。针对14种高危型HPV设计的引物和探针，可特异性的实现快速对高危型HPV E6/E7mRNA的检测，检测时间仅用2.5h。本发明专利技术的试剂盒具有快速、高效、敏感度高、特异性好以及可实时检测分析等特点，为HPV的普查和宫颈癌防治提供了快速准确的分子检测方法，同时大大降低了检验成本，具有重要的推广应用价值。

A primer, kit for detection of high-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA and its detection method

The invention relates to a high-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection kit, and discloses the detection method of the kit. The method included the first step of reverse transcription using random primers, and the second step of detection of 14 high-risk HPV E6/E7 mRNA and internal reference genes in a PCR reaction. Primers and probes designed for 14 types of high-risk HPV can be used to detect the E6/E7 mRNA of high-risk HPV rapidly and specifically. The detection time is only 2.5 hours. The kit has the characteristics of fast, high efficiency, high sensitivity, good specificity and real-time detection and analysis. It provides a rapid and accurate molecular detection method for the general survey of HPV and the prevention and control of cervical cancer. It also greatly reduces the cost of inspection, and has important value for popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测用引物、试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生命科学领域和生物
，尤其涉及一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测用引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科，是一种嗜上皮性病毒。它对表皮和粘膜鳞状上皮具有特殊嗜性，为无包膜的双链环状DNA病毒，具有高度的特异性，且在人和动物中分布广泛。HPV基因组共由3个基因区组成，包括早期区(EarlyRegion，E区)、晚期区(LateRegion，L区)和与非编码区(UncodingRegion，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。UCR含有HPV基因组DNA的复制起点和调控HPV病毒的转录与复制表达所必需的元件。人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)经过完全测序后可归类成120多种基因型，其中有50余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，导致尖锐湿疣糜烂，甚至可能引起癌症的发生。根据其是否可以引起癌变，HPV亚型可分为“低危”型和“高危”型，前者主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)；后者的感染是引发宫颈癌的主要致病因素。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年内痊愈，但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。研究发现，中国妇女HPV感染率的年龄组分布曲线呈现出两个高峰(20-24岁和40-44岁)，HPV的感染正日益普遍的影响着中国妇女的生活质量和身心健康。宫颈癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，而高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV的感染使得宫颈癌的相对危险性增加了250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。事实上，约99.7％的宫颈癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV16、18、31、33、35的反复或持续感染所致。因此，高危HPV病毒是目前最为明确的致癌病毒，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。临床上HPV分型检测是应用分子生物学的方法检测病毒的核酸，主要集中在以靶序列扩增为基础的检测技术(如荧光-PCR法)和以信号放大为基础的检测技术(如杂交捕获法)。国内市场上HPV核酸检测试剂盒检测的靶序列主要针对HPV的L1基因序列和全基因组序列，这些方法是以病毒基因组DNA作为靶序列，检测样本载有的病毒类型及负荷量。实际上宫颈细胞的病变程度不仅与病毒类型以及负荷量相关，也与致癌基因的活动程度密切相关。HPVE6/E7信使核糖核酸(messengerRNA，mRNA)是病毒癌基因的转录产物，它在宫颈组织中表现出癌基因的活性，HPVE6/E7mRNA水平与病变的严重程度相关。研究表明，与HPVDNA检测相比，HPVE6/E7mRNA检测可能是一种更有效的方式，为感染高危型HPV的妇女提供了更准确的风险预测。2006年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPVE6/E7mRNA检测可以作为HPV相关的分子标记物之一进行研究。而随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合，基于核酸扩增的技术也得到了快速的发展。如RT-PCR技术、核酸杂交技术、双链RNA(dsRNA)电泳技术、环介导等温扩增技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。目前商业化的HPVE6/E7mRNA检测方法主要有美国Hologic公司的AptimaHPV检测技术、美国DiaCarta公司的QuantiVirusHPV检测技术、法国BioMerieux公司的NucliSENSEasyHPV检测技术以及挪威PreTectAS公司的PreTectHPV-ProoferHPV检测技术。这些技术涉及基于转录介导等温扩增技术(TMA)原理、基于分支链DNA信号放大技术(bDNA)原理以及基于实时多重核酸序列依赖性扩增技术(Real-TimeNASBA)原理。这些方法均可有效检测临床样本中存在的高危型HPVE6/E7mRNA，但操作步骤较为繁琐且成本较高，不利于高危型HPV筛查工作的大范围开展。目前单重RT-PCR是应用最广泛的病毒分子生物学检测方法，具有灵敏、快速、特异性强等优点，但单重RT-PCR一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用高，耽误时间。近些年逐渐发展起来的多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReact-ion)，其优点是可以在一种样品中同时鉴别多种病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低检测费用，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。该技术结合荧光探针后可利用荧光信号的积累实现实时监测PCR扩增反应的全过程从而能实时分析检测结果，是一种高通量、高效率、操作简便快捷的HPVE6/E7mRNA的检测方法。建立稳定灵敏的多重RT-PCR技术，实现在同一反应管中同时对14种高危型HPVE6/E7mRNA进行鉴别检测，可提高检测准确性，缩短检测周期，降低检测成本。人乳头瘤病毒的准确检测对宫颈癌的早期预防具有重要价值。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了基于多重RT-PCR技术的一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测试剂盒及其检测方法，以弥补现有检测方法的不足。本专利技术提供以下技术方案：一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测用引物，包括15对正、反向引物对以及15条特异性探针，分别针对14种高危型HPVE6/E7mRNA和内参基因β-ActinmRNA的检测，其核酸序列为：(1)检测HPV16的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.1～2所示，检测HPV16的探针，其核酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)检测HPV18的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.4～5所示，检测HPV18的探针，其核酸序列如SEQIDNO.6所示；(3)检测HPV31的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.7～8所示，检测HPV31的探针，其核酸序列如SEQIDNO.9所示；(4)检测HPV33的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.10～11所示，检测HPV33的探针，其核酸序列如SEQIDNO.12所示；(5)检测HPV35的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.13～14所示，检测HPV35的探针，其核酸序列如SEQIDNO.15所示；(6)检测HPV39的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.16～17所示，检测HPV39的探针，其核酸序列如SEQIDNO.18所示；(7)检测HPV45的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.19～20所示，检测HPV45的探针，其核酸序列如SEQIDNO.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测用引物，其特征在于，包括15对正、反向引物对以及15条特异性探针，分别针对14种高危型HPV E6/E7 mRNA和内参基因β‑Actin mRNA的检测，其核酸序列为：(1)检测HPV16的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，检测HPV16的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；(2)检测HPV18的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，检测HPV18的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示；(3)检测HPV31的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.7～8所示，检测HPV31的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.9所示；(4)检测HPV33的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，检测HPV33的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.12所示；(5)检测HPV35的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.13～14所示，检测HPV35的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.15所示；(6)检测HPV39的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.16～17所示，检测HPV39的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.18所示；(7)检测HPV45的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.19～20所示，检测HPV45的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.21所示；(8)检测HPV51的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.22～23所示，检测HPV51的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.24所示；(9)检测HPV52的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.25～26所示，检测HPV52的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.27所示；(10)检测HPV56的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.28～29所示，检测HPV56的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.30所示；(11)检测HPV58的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.31～32所示，检测HPV58的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.33所示；(12)检测HPV59的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.34～35所示，检测HPV59的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.36所示；(13)检测HPV66的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.37～38所示，检测HPV66的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.39所示；(14)检测HPV68的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.40～41所示，检测HPV68的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.42所示；(15)检测内参基因β‑Actin的引物对，其核酸序列如SEQ ID NO.43～44所示，检测内参基因β‑Actin的探针，其核酸序列如SEQ ID NO.45所示。...

【技术特征摘要】
1.一种高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测用引物，其特征在于，包括15对正、反向引物对以及15条特异性探针，分别针对14种高危型HPVE6/E7mRNA和内参基因β-ActinmRNA的检测，其核酸序列为：(1)检测HPV16的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.1～2所示，检测HPV16的探针，其核酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)检测HPV18的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.4～5所示，检测HPV18的探针，其核酸序列如SEQIDNO.6所示；(3)检测HPV31的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.7～8所示，检测HPV31的探针，其核酸序列如SEQIDNO.9所示；(4)检测HPV33的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.10～11所示，检测HPV33的探针，其核酸序列如SEQIDNO.12所示；(5)检测HPV35的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.13～14所示，检测HPV35的探针，其核酸序列如SEQIDNO.15所示；(6)检测HPV39的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.16～17所示，检测HPV39的探针，其核酸序列如SEQIDNO.18所示；(7)检测HPV45的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.19～20所示，检测HPV45的探针，其核酸序列如SEQIDNO.21所示；(8)检测HPV51的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.22～23所示，检测HPV51的探针，其核酸序列如SEQIDNO.24所示；(9)检测HPV52的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.25～26所示，检测HPV52的探针，其核酸序列如SEQIDNO.27所示；(10)检测HPV56的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.28～29所示，检测HPV56的探针，其核酸序列如SEQIDNO.30所示；(11)检测HPV58的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.31～32所示，检测HPV58的探针，其核酸序列如SEQIDNO.33所示；(12)检测HPV59的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.34～35所示，检测HPV59的探针，其核酸序列如SEQIDNO.36所示；(13)检测HPV66的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.37～38所示，检测HPV66的探针，其核酸序列如SEQIDNO.39所示；(14)检测HPV68的引物对，其核酸序列如SEQIDNO.40～41所示，检测HPV68...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，潘彩霞，吕江峰，
申请(专利权)人：杭州迪安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33