本发明专利技术公开了一种棒杆菌启动子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供的启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(‑1)，解决了在谷氨酸棒杆菌中启动子强度不够强的问题。将启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(‑1)直接导入棒杆菌的待表达基因前，应用于基因的表达及相关代谢产物的生产，提供了比Psod和Ptuf更强的启动子。本发明专利技术还可应用于协调棒杆菌中其它基因的表达及相关代谢产物的合成。
A Corynebacterium tumefaciens promoter and its application
The invention discloses a Corynebacterium promoter and its application, belonging to the field of gene engineering technology. The promoters PdnaK, PdnaK (+1) and PdnaK (1) provided by the invention solve the problem of insufficient promoter strength in Corynebacterium glutamicum. Before the promoter PdnaK, PdnaK (+1) and PdnaK (1) were directly introduced into the gene to be expressed, it was applied to gene expression and production of related metabolites, providing a stronger promoter than Psod and Ptuf. The invention can also be applied to coordinate the expression of other genes in Corynebacterium and the synthesis of related metabolites.
【技术实现步骤摘要】
一种棒杆菌启动子及其应用
本专利技术涉及一种棒杆菌启动子及其应用，尤其是一种棒杆菌中的胁迫感应启动子PdnaK及其应用，属于基因工程
技术介绍
启动子位于转录起始点上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，由此启动转录。棒杆菌是安全生产菌，无内毒素及胞外水解酶活性，广泛应用于多种氨基酸及有机酸的生产，如谷氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，尼龙-4等，其产品可作为饲料添加剂，食品添加剂，医药中间体，可降解塑料的前体，在化妆品行业也有着重要应用。近年来棒杆菌启动子工程取得了很大的进展，棒杆菌基因组上的启动子如Psod，Ptuf，PcspB等近年来被应用于增强相关基因的表达，并取得了一定的成效。虽然组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子等都有所报道，但是真正应用于棒杆菌的还比较少，且迫切需求更多的启动子来增强基因的表达，平衡代谢流，以实现高产目的代谢产物的目标。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了几种适用于棒杆菌的启动子，将其连接到表达载体上，或者将其插入棒杆菌染色体上待表达基因的前面，构建重组菌，可用于表达相关的基因，催化相关代谢产物的合成。所述启动子，包括SEQIDNO.1所示的PdnaK、SEQIDNO.2所示的PdnaK(+1)、SEQIDNO.3所示的PdnaK(-1)。所述启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)是谷氨酸棒杆菌中编码热激蛋白的dnaK基因上游的序列，dnaK基因是胁迫感应基因。所述启动子PdnaK(+1)是在PdnaK的基础上向下游延伸60bp。所述启动子PdnaK(-1)是在PdnaK的基础上向上游延伸60bp。所述启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)可用于构建各种表达载体，例如用于表达载体pJYW-4，pJYW-5，pDXW-8，pDXW-10等。所得表达载体可以用于在各种棒杆菌属中表达基因或合成特定代谢产物，例如谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌等。所述启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)可以应用于在谷氨酸棒杆菌中表达谷氨酸脱羧酶基因(gadB2)。例如，以谷氨酸高产的谷氨酸棒杆菌为宿主，以PdnaK或PdnaK(+1)或PdnaK(-1)作为gadB2的启动子表达谷氨酸脱羧酶。可以pJYW-5为载体，将其已有PtacM启动子切掉替换为启动子PdnaK，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)，构建重组表达载体。本专利技术有益效果：本专利技术提供的启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)在发酵的中后期转录水平明显上调，适用于前期微弱表达，后期增强表达的状况，例如前期积累底物，后期转化合成产物的相关发酵，而常用的启动子如Psod，Ptuf等均属于组成型表达，而诱导启动子需添加诱导剂，增加生产成本且不安全。具体实施方式下面通过实例来证明Pdnak，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)启动子的应用，但并非局限于只能用作谷氨酸脱羧酶基因的启动子，还可应用于棒杆菌中任何基因及相关代谢产物的合成。菌株：本专利技术所用到的菌株：高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌本实验室储藏，大肠杆菌JM109购自天根生物公司。试剂：限制性内切酶XbaI，PstI，T4DNA连接酶，PCR试剂均购自Thermo公司，基因组提取试剂盒，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒，卡那霉素均购自上海生工，其他试剂均为国产或进口的分析纯试剂。种子培养基(100ml)：葡萄糖2.5％，玉米浆3％，尿素0.8％，K2HPO4·3H2O0.1％，MgSO40.02％，NaOH调pH7.2。发酵培养基(100ml)：葡萄糖10％，K2HPO4·3H2O0.2％，玉米浆0.2％，MgSO40.04％，MnSO4·H2O2mg/L，FeSO4·7H2O2mg/L，NaOH调pH7.2。启动子对gadB2的表达效果测定：(1)实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR主要用于检测gadB2的转录水平，取20h和40h发酵液，提取RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR的测定；(2)谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活检测：GAD酶活测定时，取40h发酵液，测定OD值，离心去上清，用pH7.2的磷酸缓冲液洗两次，去除发酵液及胞外粘附的杂质，再将细胞悬浮在含0.1％Triton的0.02MpH4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，获得全细胞液；GAD酶促反应体系为1ml，包括0.2MpH5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，30mM的谷氨酸钠，0.03mM的磷酸吡哆醛及400μl全细胞液，底物和全细胞提前于37℃预热10min，然后全细胞液加到反应体系中，于37℃反应1h，再煮沸10min结束反应，离心20min，上清用于检测合成的γ-氨基丁酸(GABA)含量；(3)高效液相色谱OPA柱前衍生法测定GABA产量：发酵液上清用终浓5％的TCA(三氯乙酸)稀释50倍，沉淀4h以上，12000rpm离心30min去除沉淀，取上清用于检测γ-氨基丁酸及谷氨酸的含量。实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK强度检测1、以上游引物PdnaK-F:5'-CGCGTCTAGAATTGGGTGGTTGAAAATTAG-3'下游引物PdnaK-R:5'-CGCGTCTAGAGTGATTTTAGTACTGTCCA-3'扩增启动子片段PdnaK(SEQIDNO.1)，将启动子PdnaK与测试质粒pJYW-5-gadB2(pJYW-5构建方法见公开号CN103834679A、专利技术名称“一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统”的专利，pJYW-5在酶切位点XbaI及PstI之间连gadB2，gadB2见公开号CN102154345A、专利技术名称“谷氨酸脱羧酶基因及其应用”的专利)用XbaI酶切，载体需要去磷酸化，然后将启动子片段和载体用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞JM109，挑选出正确的转化子，构建pJYW-5-PdnaK-gadB2。2、将质粒pJYW-5-PdnaK-gadB2电转进谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，挑选出正确转化子，SH/pJYW-5-PdnaK-gadB2。3、将活化好的重组谷氨酸棒杆菌SH/pJYW-5-PdnaK-gadB2接种到30ml种子培养基，30℃、200rpm，培养8h，转接到发酵培养基中，初始OD5621.9接到发酵培养基，10h-24h，通过补加尿素的方法维持发酵液pH在6.5-7.5，从24h开始，每12h取样测定OD、残糖、pH、GABA产量等各参数，直至72h发酵结束。发酵各参数测定结果表明，含Pdnak菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的4.59倍、39.7倍，是含Ptuf菌株的3.09倍、54.3倍；含PdnaK菌株的谷氨酸脱羧酶活性是含Psod、Ptuf菌株的10倍、1.68倍；从72hGABA积累情况来看，含PdnaK菌株比含Psod、Ptuf菌株分别提高了2.29倍和10％，综合三方面均证明启动子PdnaK比对照启动子Psod、Ptuf更强。实施例2：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK(+1)强度检测1、以：上游引物PdnaK(+1)-F:5'-CGCGTCTAGAATTGGGTGGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。2.携带权利要求1所述启动子的载体。3.携带权利要求1所述启动子或权利要求2所述载体的细胞。4.权利要求1所述启动子在表达基因或合成特定代谢产物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌等棒杆菌属为宿主。6.权利要求2所述载体在表达基因或合成特定...
【专利技术属性】
技术研发人员：史锋，栾明月，李永富，李烨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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