干细胞移植方法和干细胞移植组合物技术

本发明专利技术公开涉及造血干细胞或祖细胞移植领域。更具体地，提供了通过与内皮细胞共培养和共同施用来改善造血干细胞或祖细胞的扩增和植入的方法、组合物和试剂盒。该方法、组合物和试剂盒可用于治疗与由疾病或清髓治疗引起的造血功能缺陷相关的各种疾病。

Stem cell transplantation and stem cell transplantation composition

The invention relates to the field of transplantation of hematopoietic stem cells or progenitor cells. More specifically, methods, compositions, and kits for improving the amplification and implantation of hematopoietic stem cells or progenitor cells by co culture with endothelial cells and co application are provided. The method, composition and kit can be used to treat various diseases related to hematopoietic deficiency caused by disease or myeloablative therapy.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干细胞移植方法和干细胞移植组合物相关申请的交叉引用本申请要求于2015年7月20日提交的美国临时专利申请No.62/194,460的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。参考引用为了仅允许通过引用并入的那些管辖权的目的，本专利技术公开中引用的所有参考文献通过引用整体并入本专利技术。此外，本专利技术引用或提及的任何产品的任何制造商提供的说明书或目录，通过引用并入本专利技术。通过引用结合到本专利技术中的文件或其中的任何教导可以用于本专利技术的实践中。背景
本专利技术涉及用于改善干细胞疗法的方法和组合物，具体涉及用于促进造血干细胞和祖细胞的扩增和植入、以及干细胞移植受体的造血系统的免疫重建的方法和组合物。介绍造血干细胞或祖细胞移植(Hematopoieticstemorprogenitorcelltransplantation,HSCT)是各种血液疾病治疗手段的重要组成部分。一般来说，有两种类型的HSCT：自体移植和异体移植。自体移植涉及在清髓治疗后注入受体自身的细胞。自体细胞移植将移植物抗宿主病(GVHD)的风险降至最低，因而减少并发症。异体移植涉及注入供体干细胞，通常使用与受体的MHC匹配的供体。然而，匹配的无关供者(MUD)移植也与更强的移植物抗宿主反应有关，因此导致死亡率升高。造血干细胞和/或祖细胞(hematopoieticstemand/orprogenitorcells,HSPC)有三种主要来源：骨髓、外周血和脐带血。脐带血(UCB)是其他造血祖细胞来源(例如骨髓和动员外周血)的实用替代来源，用于相关和不相关的异基体造血干细胞移植。然而不幸的是，尽管脐带血容易获得并且移植物抗宿主病的发生率较低，但它也存在多细胞系细胞(例如嗜中性粒细胞、血小板、红细胞)的移植延迟的特点，而这些对于成功和临床上的免疫重建都具有重要意义。因此，虽然有望利用从脐带血中获得的HSPC治疗血液系统疾病，但是造血恢复的速率缓慢仍然是一个主要障碍(Laughlin等人，N.Eng.J.Med.351:22；2265-2275(2004))，并且植入效率仍然显著低于来自骨髓或外周血的HSC(Rocha等人，N.Eng.J.Med.351:22；2276-2285(2004))。造血干细胞可以在包含细胞因子混合物的不同培养基组合物中扩增。干细胞扩增技术在本领域中是已知的，如美国专利6,326,198，美国专利6,338,942，美国专利第6,335,195号。小林等人和巴特勒(Butler)等人最近描述了通过用腺病毒E4ORF1基因对自原代人内皮细胞(EC)进行转导产生亲造血血管生态位，所述腺病毒E4ORF1基因最小程度地激活导致促造血存活和增殖信号的表达的Akt/Mtor途径(Kobayashi等人，NatureCellBiology12,1046-1056(2010)；Butler等人，Blood120,1344-1347(2012))。典型的HSPC/EC扩增程序使用初始的EC：HSPC比率为6：1至3：1，将HSPC共培养于保存在小细胞培养瓶中的单层EC上。24-48小时后，将HSPC移出并沉积在第二个烧瓶中的另一单层EC上，依此类推，直到获得所需数量的HSPC。然而，这种基于烧瓶的扩增的一个重大缺陷是开放事件的数量很高，每一个典型程序中多达1,800个，这大大增加了污染的风险。目前对于能够在临床上有用地扩增人类CD34+HSPC以及其他造血元素的体外培养方法和系统仍然存在需求。需要能够产生大量某些骨髓元素的系统来提供足够量的元素用于人类治疗，例如骨髓移植、可输血的血液成分或基因疗法。这里描述的方法满足上述以及其他需求。
技术实现思路
本专利技术针对并成功地解决了本领域中长期存在的需求，通过在封闭系统生物反应器中使用至少25：1、50：1、100：1或500：1，或更优选的高达1000：1、2000：1或3000：1的初始EC/HSPC比率对HSPC与内皮细胞进行共培养从而提供空前水平的HSPC扩增。重要的是，HSPC和EC之间的相互作用在扩增过程中不受干扰，从而保持了HSPC和EC之间的连续的细胞间通讯，提高了扩增效率和总体产出。此外，与开放细胞培养环境(例如培养瓶)相比，开放事件的数量减少也大大降低了污染风险。根据本专利技术所述的方法扩增的HSPC具有有益的药理学作用，特别是当与EC结合施用于HSCT受体时，其中在整个扩增和施用期间在HSPC和EC之间保持连续的相互作用。这些同种异体内皮细胞在血液循环和/或组织中的短暂存在提供了HSCT中有益的体内结果，例如增强的多谱系植入和更长的植入期，以及相对快速的初始植入，例如，通过嗜中性粒细胞计数进行检测。如本专利技术第一次所证实的，即使内皮细胞在与HSC共培养之前进行照射并且不能复制，情况也是如此。因此，本专利技术一个方面涉及在有此需要的个体中进行干细胞移植的方法，其包括：(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中，其中在整个扩增步骤和输入步骤中HSPC和EC之间保持连续的相互作用。本专利技术另一方面涉及包含HSPC和EC的组合物，其用于在有此需要的个体中的干细胞移植，其中所述干细胞移植包含本专利技术所述的方法。优选地，EC在整个扩增和输入步骤中持续地与HSPC相邻，如本专利技术所述和所示。更优选地，EC至少在扩增步骤期间与HSPC连续接触。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约200：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约300：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约400：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约500：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约600：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约700：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约1000：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约2000：1。在一些实施方式中，初始EC/HSPC比率为至少约3000：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约10：1至约1：10。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率是约10：1至约1：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约9：1至约2：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比例为约8：1至约3：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约7：1至约4：1。在一些实施方式中，扩增的HSPC/EC比率为约6：1至约5：1。本专利技术的另一方面涉及根据本专利技术所述的方法分离、扩增、保存和施用HSPC和内皮细胞的试剂盒或系统。附图说明本领域技术人员将会理解，附图仅用于说明的目的，并不意图以任何方式限制本专利技术教导的范围。图1显示了经辐射照射效果的E4ORF1+工程化的EC的相位显微镜图像。在标准培养条件下收获EC并用E4ORF1转导。然后将细胞分成两个烧瓶并进一步培养至100％融合。一个容器未被处理(左图)，另一个容器用铯照射器用1500cGy照射(右图)。通过相差显微镜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在有需要的个体中进行干细胞移植的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中；其中，在整个扩增步骤和输入步骤中，所述HSPC和EC之间保持连续的相互作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.20 US 62/194,4601.一种在有需要的个体中进行干细胞移植的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)扩增造血干细胞或祖细胞(HSPC)：通过在允许HSPC扩增的条件下，使HSPC与内皮细胞(EC)以初始EC/HSPC比率接触第一时间段，从而以扩增的HSPC/EC比率产生包括HSPC和EC的扩增的细胞群；和(b)将从步骤(a)获得的扩增的细胞群输入到个体中；其中，在整个扩增步骤和输入步骤中，所述HSPC和EC之间保持连续的相互作用。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC是造血干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC相对于所述个体是同种异体的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述HSPC是脐带血HSPC。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC相对于所述个体是自体的。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HSPC是基因修饰的稳态骨髓来源的HSPC。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC是血管EC。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC在扩增之前经有丝分裂灭活。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC是E4ORF1+工程化的EC。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EC是E4ORF1+ETV2+工程化的EC。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述EC也是E4ORF6+。12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述EC包含编码ETV2多肽的重组核酸分子。13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述EC包含编码腺病毒E4ORF1多肽的重组核酸分子。14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述EC包含编码腺病毒E4ORF6多肽的重组核酸分子。15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸分子为质粒载体的形式。16.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸分子整合到所述工程化的EC的基因组DNA中。17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是分化的EC。18.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是成体EC。19.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC不是胚胎EC。20.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是人EC。21.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是原代EC。22.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述EC是人脐静脉EC(HUVEC)。23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始EC/HSPC比率为至少约200：1。24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一时间段为约1天至约24天。25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的细胞群包含约1.0×106至约1.0×108个HSPC/kg个体。26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的HSPC/EC比率为约10：1至约1：10。27.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC与EC之间的连续的相互作用包括在所述扩增步骤中所述HSPC与EC之间的连续接触，以及在所述扩增步骤和输入步骤中的所述HSPC与EC的连续接近。28.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入所述个体约15天至约35天后，所述个体的循环血液中的血小板计数为至少约20,000/μL。29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约5天至约20天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约100/μl。30.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约10天至约25天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约500/μl。31.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述扩增的细胞群输入个体约1,000天后，所述个体的循环血液中的嗜中性粒细胞绝对计数为至少约500/μl。32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体具有由清髓性治疗引起的造血功能障碍或选自以下的病症：血液病、需要骨髓造血干细胞移植的病症、感染性...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·威廉·芬尼根，克劳德·杰弗里·戴维斯，迈克尔·丹尼尔·金斯伯格，丹尼尔·约瑟夫·诺兰，
申请(专利权)人：安吉克莱茵生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US