用于改进的蛋白质分离的相反的pH-盐梯度制造技术

本发明专利技术涉及用于从其相关的电荷变体（例如酸性与碱性单体）、糖基化变体和/或可溶性尺寸变体（例如聚集体、单体、2/3片段、¾片段、抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)）中改进的制备分离蛋白质，特别是单克隆抗体（mAB）的方法。

Opposite pH- salt gradient for improved protein separation

The present invention relates to an improved preparation of separated proteins, especially monoclonal antibodies (mAB), from their related charge variants (such as acid and alkaline monomers), glycosylated variants and / or soluble dimensional variants, such as aggregates, monomers, 2/3 fragments, fragment fragments, antigen binding fragments (Fab) and crystallizable fragments (Fc). The way.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改进的蛋白质分离的相反的pH-盐梯度本专利技术涉及用于从其相关的电荷变体（例如酸性与碱性单体）、糖基化变体和/或可溶性尺寸变体（例如聚集体、单体、2/3片段、抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)）中改进的制备分离蛋白质，特别是单克隆抗体（mAB）的方法。专利技术背景蛋白质异质性因体内翻译后修饰而产生，或经由化学和酶促反应人工产生，或因机械应力、高温或极端pH作为发酵和纯化过程中的副产物产生[1-4]。与mAb相关的蛋白质异质性包括但不限于电荷变体（如酸性和碱性变体）、糖基化变体和尺寸变体（如聚集体、单体、片段、Fab和Fc残基）[5-7]。在治疗性mAb中，此类产物变体导致不同的药代动力学和药效动力学，这将影响药物的稳定性、功效和效力[1]。因此，它们必须被彻底剖析并从最终产品池中除去。液相色谱法（LC）用作mAb生产的标准纯化工具[8]。用于mAb的通用下游工艺（DSP）包括但不限于A蛋白亲和色谱法（AC）、离子交换色谱法和疏水作用色谱法（HIC）[9]。IEC（离子交换色谱法）如强阳离子交换色谱法（SCX）、弱阳离子交换色谱法（WCX）和弱阴离子交换色谱法（WAX）以分析规模广泛使用以分离具有非常相似的等电点（pI）的mAb电荷变体与其它蛋白变体，其包括但不限于尺寸变体、糖基化变体、唾液酸化（sialylation）变体和C-端/N-端加工变体[7、10-14]。虽然使用具有固定pH值的氯化钠的浅盐梯度斜率可用于表征mAb变体，其在电荷变体分离中的应用是蛋白特异性的，并必须针对个别mAb进行优化[15]。色谱聚焦（CF）是盐梯度的替代，其中使用聚两性电解质缓冲剂在该柱内部[16-21]或通过在该柱入口处混合两种具有不同pH值的适当的缓冲剂（其随后流通穿过该柱）在外部[22-26]生成pH梯度。取决于相应的pI值，mAb电荷变体在pH梯度中的不同点处聚焦，并因此导致高分辨的峰[27]。高性能CF在IEC中用于mAb电荷变体分离的初始应用限于具有7.3至9.0的pI范围的中性与碱性mAb[28-29]。近来发现，这种应用谱系可以通过调节pH梯度中的离子强度扩展至酸性mAb（pI=6.2）[29]。据报道[29]，在提高和受控的离子强度下的pH梯度已经对酸性、中性和碱性获得更好解析的峰。虽然上述实例描述了分析规模下盐介导的pH梯度对mAb电荷变体分离的成功，Kaltenbrunner等人[30]在更早时已经声称他们的使用甘露醇、硼酸盐和氯化钠的pH-盐混合梯度能够在制备规模上分离mAb同种型。他们已经使用由pH7.0至9.1的递增pH梯度结合递减的盐梯度来分离具有8.15至8.70的pI的同工蛋白质。但是，在他们的方法中发现了一些限制、缺点和矛盾。例如，他们建议的方法仅适于分离糖蛋白同种型，其在多个碳水化合物侧链方面不同[29-30]。这限制了此类梯度体系的使用仅限于糖基化蛋白质，由此令其对其它类型的mAb变体如电荷或尺寸同种型而言不切实际。尽管其声称提高的峰间分辨率归因于pH-盐混合梯度，在含有顺式二醇的寡糖与缓冲剂组分硼酸盐之间的非特异性反应是否对所述改进的分离具有显著影响还不清楚[29]。此外，它们的所谓同工蛋白质的“制备”分离仅为0.5毫克mAb/毫升填充树脂[30]，这对生产规模分离仍然太低。迄今为止，对WCX–Fractogel®COO-（M）报道了使用pH-盐混合梯度体系的生产规模（≥30毫克/毫升）mAb电荷变体分离[31]。但是，使用乙酸盐产生了递增的pH梯度伴随着递增的盐梯度体系，并且其仅涵盖了5至6的非常狭窄的pH范围，由此将这种方法限于具有大约5.6的洗脱pH的mAb。应当指出，在他们的pH-盐混合梯度中使用的pH范围非常接近于羧基官能团的pKa（pKa=4.5）。对于WCX，已知的是除了流动相中使用的缓冲物类外，树脂主链上的官能团也将导致瞬时pH变化，尤其在接近羧基基团的pKa的pH处[32-33]。由于他们的研究中使用的pH范围非常接近于羧基基团的pKa，有理由预测，除了流动相中使用的乙酸盐之外，树脂主链上部分质子化的羧基基团也将向该梯度体系提供一定的缓冲容量。此外，还不清楚该混合pH-盐体系中的pH梯度是否由单独的乙酸盐缓冲剂产生，或是否其为羧基基团与乙酸盐的组合效应。同样，还不能确定这种效应是否在电荷变体分离中起主要作用。同样，对这种类型的树脂推荐的正常工作pH范围为6至8，在该范围中，羧基基团将充分脱质子化（即离子化）。如果其在低于6的pH值下工作，该WCX可能遭受容量损失。尽管在他们的研究中报道了38至54克/升填充树脂的高结合容量[31]，这一结果可能是蛋白质特异性的，这与论文中的最终信息一致——即他们的研究中显示的分离效率仅针对特定的抗体。对高于6的pH未给出其它分离实例和在他们的研究中没有使用其它抗体的事实令该方法用于分离其它mAb的适用性存在疑问。几个专利[34-36]要求保护CEX和混合模式色谱（MMC）用于mAb变体分离的用途，其包括但不限于从mAb中清除酸性、碱性、脱酰胺基或二醇-变体。尽管如此，在这些权利要求[34-36]中应用盐浓度或pH值一次一变的单梯度洗脱和分步洗脱。此外，除了产物——mAb之外，该进料仅包含一种类型的电荷变体——酸性变体[34-36]，其是相对“纯”的。要解决的问题本专利技术的目的因此是提供一种在离子交换色谱法中用于蛋白质分离的新颖和改进的方法，其可以容易地采用可用手段进行，并且不需要附加的分离步骤。蛋白质的分离包括肽的分离。专利技术概述本专利技术涉及通过以下步骤从蛋白质混合物中分离和纯化蛋白质的方法：a）提供包含至少两种不同蛋白质的样品b）将该混合物施加至离子交换材料c）通过递增的pH和递减的盐浓度来运行相反的pH-盐梯度以分离蛋白质，或相反运行递减的pH和递增的盐浓度以分离蛋白质，并且任选地d）利用来自c）的分离数据限定用于蛋白质分离的分步洗脱曲线（stepelutionprofile）。由此，该蛋白质可以在梯度洗脱中分离。有利地，本专利技术的方法可以用≥5毫克/毫升、尤其≥30毫克/毫升、特别是≥60毫克/毫升的高总蛋白质负载来进行。为此，将蛋白质的混合物吸附或结合到离子交换材料上并从离子交换材料上洗脱。这意味着蛋白质混合物可以在适当的条件下负载在阳离子或阴离子或混合模式的离子交换材料上并从该离子交换材料上洗脱。如果在c）中pH在4.5-10.5范围内变化且盐浓度在0-1M盐范围内改变的话，可以获得良好的分离结果。如果通过施加在pH5至9.5之间调节的缓冲体系产生pH梯度和如果在0-0.25M的浓度范围内产生盐梯度的话，该分离结果尤其良好。本专利技术的分离方法可以通过经由施加至少两种缓冲溶液的缓冲体系以产生pH梯度来处理，由此在一种缓冲溶液的存在下发生蛋白质的所需吸附或结合，并且在渐增浓度的另一缓冲溶液的存在下发生洗脱，而pH递增且盐浓度同时递减或相反——其中pH递减且盐浓度同时递增。适于产生pH梯度的缓冲体系采用MES、MOPS、CHAPS等等，以及使用氯化钠的电导率改变体系。优选蛋白质的分离和纯化首先通过将蛋白质的混合物吸附或结合到阳离子交换材料或混合模式色谱材料上来进行。随后从与其相关的电荷变体、糖基化变体和/或可溶性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从蛋白质的混合物中分离和纯化蛋白质的方法，其通过以下步骤：a）提供包含至少两种不同蛋白质的样品，b）以≥5毫克/毫升、尤其≥30毫克/毫升、特别≥60毫克/毫升的总蛋白质负载将该混合物施加至离子交换材料，c）通过特征在于同时改变pH和电导率的洗脱来分离所述蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.18 EP 15195243.91.用于从蛋白质的混合物中分离和纯化蛋白质的方法，其通过以下步骤：a）提供包含至少两种不同蛋白质的样品，b）以≥5毫克/毫升、尤其≥30毫克/毫升、特别≥60毫克/毫升的总蛋白质负载将该混合物施加至离子交换材料，c）通过特征在于同时改变pH和电导率的洗脱来分离所述蛋白质。2.如权利要求1所述的用于从蛋白质的混合物中分离和纯化蛋白质的方法，其通过以下步骤：a）提供包含至少两种不同蛋白质的样品，b）将该混合物施加至离子交换材料，c）通过递增的pH和递减的盐浓度来运行相反的pH-盐梯度以分离蛋白质，或相反运行递减的pH和递增的盐浓度，并且任选地d）利用来自c）的分离数据限定和运行用于蛋白质分离的分步洗脱曲线。3.如权利要求1或2所述的用于从蛋白质的混合物中分离和纯化蛋白质的方法，其通过以下步骤：a）提供包含至少两种不同蛋白质的样品，b）将该混合物施加至离子交换材料，c）通过递增的pH和递减的盐浓度来运行相反的pH-盐梯度以分离蛋白质，或相反运行递减的pH和递增的盐浓度，并且d）在梯度洗脱中分离所述蛋白质。4.如权利要求1、2或3的一项所述的方法，其中总蛋白质负载为≥5毫克/毫升、尤其≥30毫克/毫升、特别≥60毫克/毫升。5.如权利要求1至4的一项或多项所述的方法，其中蛋白质的混合物吸附或结合到离子交换材料上并从离子交换材料上洗脱。6.如权利要求1至4的一项或多项所述的方法，其中蛋白质的混合物吸附到阴离子或阳离子交换材料上并从阴离子或阳离子交换材料上洗脱。7.如权利要求1、2或3所述的方法，其中蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：M约恩克，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE