一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用技术

本发明专利技术涉及生物相容性微胶囊的制备及应用技术领域，具体涉及一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用。以具有生物相容性的两相磷酸钙颗粒为自组装基元，以骨形成蛋白水溶液为分散相，玉米油为连续相制备稳定的油包水型微胶囊。固体粒子不需要预修饰，在乳液形成过程中玉米油中的脂肪酸可以同步修饰颗粒，实现了一步构建油包水型微胶囊。该微胶囊材料在骨形成蛋白的作用下，利用β‑磷酸三钙的降解产物原位生物矿化，来进行骨质的修复。此方法制备微胶囊过程简单，所用油相可适用于基于玉米油系列的其他植物油，具有普适性。利用自组装技术制备具有生物活性的人造无机原细胞，为自组装技术在生命科学领域的应用提供了广阔的前景。

One step construction of two phase calcium phosphate microcapsules and its application in bone repair

The invention relates to the technical field of preparation and application of biocompatibility microcapsules, in particular to a one step construction method of two phase calcium phosphate microcapsules and its application in bone repair. The biphasic calcium phosphate particles with biocompatibility were used as self-assembled primitives, and the aqueous solution of bone morphogenetic protein was dispersed, and the stable oil coated water microcapsules were prepared by the continuous phase of corn oil. The solid particles do not need pre modification. During the formation of the emulsion, the fatty acids in the corn oil can be synchronized with the particles, and the oil encapsulation microcapsules are constructed. Under the action of bone morphogenetic protein, the microcapsules were biomineralized in situ by the degradation products of beta-tricalcium phosphate for bone repair. The preparation process of microcapsules is simple, and the oil phase used can be applied to other vegetable oils based on corn oil series. The preparation of bioactive artificial inorganic progenitor cells by self-assembly technology provides a broad prospect for the application of self-assembly technology in the field of life sciences.

【技术实现步骤摘要】
一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用
本专利技术涉及生物相容性微胶囊的制备及应用
，具体涉及一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用。
技术介绍
Pickering乳液是以固体粒子代替传统化学乳化剂分散在两互不相溶的液体中，通过界面自组装形成的热力学和动力学均稳定的分散体系。相比于传统表面活性剂稳定的乳液，Pickering乳液由于其成本低、无毒和环保等特性，在食品、化妆品、医药和材料科学等领域具有重要的应用价值，近年来受到了许多国内外研究者的广泛关注。固体颗粒能够有效稳定乳液，一个重要条件是颗粒能被乳液中的两种液体不同程度地润湿，即固体颗粒要有一定润湿性。固体粒子润湿性的大小通常用固体粒子在油/水界面的三相接触角θ来表征。当θ<90°时，固体粒子亲水性较强，有利于形成O/W型乳液；当θ＝90°时，固体粒子可以在油/水界面形成结构比较稳定的薄膜，有较好的乳化性能；当θ>90°时，固体粒子的亲油性较强，有利于形成W/O型乳液。微小粒子有巨大的表面能容易团聚，为了得到稳定的乳液，研究者多采用经表面修饰后的粒子或者是固体粒子与表面活性剂/聚合物协同稳定乳液。如(1)C.Huo,M.Li,X.Huang,H.Yang,S.Mann,Langmuir2014,30,15047；(2)Y.Iwasaki,Y.Takahata,S.Fujii,ColloidsSurf.B.Biointerfaces2015,126,394.但是对粒子的表面预修饰处理使得合成过程比较繁琐。利用亲水性固体粒子(无需表面修饰)制备稳定的油包水型Pickering乳液的方法尚未见报道。两相磷酸钙(BCP)是由羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)以一定的比例组合而成的复合材料，具有良好的生物相容性和生物活性，作为骨组织替代材料的研究已有报道，但是该材料直接暴露于环境中易耗散且释放过程不易控制。而微胶囊具有保护物质免受环境影响，控制可持续释放等多种功能，因而使用无需表面修饰的两相磷酸钙颗粒为自组装基元，一步法构建含有骨形成蛋白的微反应胶囊，保证骨形成蛋白的局部定位和缓慢释放将解决现在医疗中存在的问题，这也是本专利技术需解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供了一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用。具体是通过以亲水性两相磷酸钙颗粒(无需表面预修饰处理)为自组装基元，以玉米油为油相，一步法构建具有生物活性的人造原细胞(油包水型Pickering乳液)并用于骨修复。玉米油中含有大量的脂肪酸，在乳液形成过程中作为油相的同时可以同步修饰颗粒使其具有一定的疏水性，从而实现一步形成包载有骨形成蛋白水溶液的油包水型微胶囊，通过其缓慢释放骨形成蛋白，以可生物降解无机细胞壁的矿物质为原料，实现骨缺损处的原位矿化与修复。其成骨量相当于单独使用等量骨形成蛋白的25倍，减少了骨形成蛋白的使用，降低了骨形成蛋白大量应用的副作用。实现本专利技术目的所采用的技术方案是：一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法，步骤如下：(1)羟基磷灰石/β-磷酸三钙复合材料颗粒的制备：55℃搅拌下将(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到Ca(NO3)2水溶液中，其中，钙和磷元素的初始摩尔比Ca/P＝1.5，用氨水控制整个滴加过程溶液的pH＝7.0-8.0，滴加完毕后继续反应1-2h，得到的悬浮液在室温下静置30-40h后，将白色沉淀水洗、离心，75-85℃干燥10-15h，最后在1100℃下煅烧2-4h，得到两相磷酸钙颗粒。(2)一步法构建油包水型两相磷酸钙颗粒微胶囊将步骤(1)得到的两相磷酸钙颗粒置于容器中，加入A相，充分分散，然后将B相加入，剧烈震荡，即得油包水型两相磷酸钙颗粒微胶囊；所述A相为油相，所述B相为水相；所述油相为可被生物体自然吸收的液态植物油脂，优选自玉米油、葵花油、大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油和芝麻油中的任意一种；所述水相为具有生物相容性的骨形成蛋白溶液，优选为骨形成蛋白BMP2溶液；步骤(2)中，所述两相磷酸钙颗粒与A相的比例为15-20mg:2mL；步骤(2)中，所述两相磷酸钙颗粒与B相的比例为15-20mg:100μL；进一步，所述骨形成蛋白BMP2溶液的浓度范围为20-100μg·mL-1。上述一步法制备的具有生物活性的两相磷酸钙微胶囊生物材料通过包埋骨形成蛋白的方式，在骨骼破损处进行骨质的修复。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果如下：本专利技术的两相磷酸钙微胶囊制备过程简单，所用油相易得，成本较低，实现了骨质的高效修复生长，为自组装技术在生命科学领域的应用提供了广阔的前景。附图说明图1为本专利技术制备方法的步骤(2)一步构建油包水型两相磷酸钙颗粒微胶囊的方法的模式图。灰色不规则形状代表亲水性的两相磷酸钙颗粒(BCP颗粒)；黑色代表油相(玉米油)，即A相；内部带有螺旋状的白色球形代表骨形成蛋白水溶液，即B相。最右边是形成的微胶囊的3D图。所用两相磷酸钙颗粒无需表面修饰，直接在水油相混合环境中发生自组装，形成稳定的油包水型微胶囊。图2为本专利技术制备方法的步骤(1)得到的两相磷酸钙颗粒的扫描电镜图片。图3为本专利技术制备方法的步骤(1)得到的两相磷酸钙颗粒的XRD谱图。图4为实施例1制备的微胶囊的光学显微镜图片。图5为实施例2制备的微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图片。图6为实施例2制备的微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜3D图片。图7为实施例3经玉米油处理前及处理后的两相磷酸钙颗粒的傅里叶变换红外光谱图谱(FTIR)。图8为实施例3经玉米油处理前(左图)及处理后(右图)的两相磷酸钙颗粒的接触角测量值示意图。图9-图14为实施例4制备的各微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图片。图15为实施例5实验组和各对照组的micro-CT扫描图。图16为实施例5实验组和各对照组micro-CT扫描相对骨体积分数定量分析柱状图。图17为对比例1制备的微胶囊的荧光显微镜图片。具体实施方式下面申请人将结合具体的实施例对本专利技术产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本专利技术。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。以下实施例中，所用骨形成蛋白BMP2为杭州九源基因工程有限公司生产，生物纯，置于0-4℃的冰箱中保存，使用时先将AmgBMP2加入到BmL1v/v％的醋酸溶液中(A:B＝1:1)，后加水稀释至所需浓度；或者，当BMP2实验浓度为1mg·mL-1时直接使用。以下实施例和对比例中，原料两相磷酸钙复合材料(简称“BCP颗粒”)为申请人自制，制备方法如下：55℃搅拌下将300mL、含0.24mol(NH4)2HPO4的(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到300mL、含0.36molCa(NO3)2的Ca(NO3)2水溶液中，用28wt％氨水控制整个滴加过程中溶液的pH＝7.5，滴加完毕后继续反应2h。得到的悬浮液在室温下静置36h后，将白色沉淀水洗、离心，于80℃下干燥12h，最后在1100℃下煅烧3h，得到两相磷酸钙颗粒(以下简称“BCP颗粒”)。其扫描电镜图见图2，颗粒粒径为0.5-1.5μm。图3为BCP颗粒的XRD谱图，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法，步骤如下：（1）两相磷酸钙颗粒的制备： 55℃搅拌下将(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到Ca(NO3)2水溶液中，钙和磷元素的摩尔比Ca/P=1.5，用氨水控制整个滴加过程溶液的pH=7.0‑8.0，滴加完毕后继续反应1‑2h，得到的悬浮液在室温下静置30‑40h后，将白色沉淀水洗、离心，75‑85℃干燥10‑15h，最后在1100℃下煅烧2‑4h，得到两相磷酸钙颗粒；（2）一步法构建油包水型两相磷酸钙微胶囊将步骤（1）得到的两相磷酸钙颗粒置于容器中，加入A相，充分分散，然后将B相加入，剧烈震荡，即得油包水型两相磷酸钙微胶囊；所述A相为油相，所述B相为水相；所述油相为可被生物体自然吸收的液态植物油脂；所述水相为具有生物相容性的骨形成蛋白溶液；所述两相磷酸钙颗粒与A相的比例为15‑20mg: 2mL；所述两相磷酸钙颗粒与B相的比例为15‑20mg: 100 µL。

【技术特征摘要】
1.一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法，步骤如下：（1）两相磷酸钙颗粒的制备：55℃搅拌下将(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到Ca(NO3)2水溶液中，钙和磷元素的摩尔比Ca/P=1.5，用氨水控制整个滴加过程溶液的pH=7.0-8.0，滴加完毕后继续反应1-2h，得到的悬浮液在室温下静置30-40h后，将白色沉淀水洗、离心，75-85℃干燥10-15h，最后在1100℃下煅烧2-4h，得到两相磷酸钙颗粒；（2）一步法构建油包水型两相磷酸钙微胶囊将步骤（1）得到的两相磷酸钙颗粒置于容器中，加入A相，充分分散，然后将B相加入，剧烈震荡，即得油包水型两相磷酸钙微胶囊；所述A相为油相，所述B相为水相；所述油相为可被生物体自然吸收的液态植物油脂；所述水相为具有生物相容性的骨形成蛋白溶液；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玫，杨瑞文，时缪斯，李覃，吕康乐，黄涛，邓克俭，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42