一种检测样品菌种相对含量的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种检测样品菌种相对含量的方法。所述方法步骤如下：引物的设计；基因组的提取；荧光定量PCR；NGS16S测序；NGS分析；预测模型的建立。使用NGS和qPCR两种方法对样品中某种待测细菌的相对含量进行检测，并将NGS的分析结果与qPCR原始实验数据进行拟合和关联以建立一个预测模型，从而使之后qPCR对样品的测试数据可以输入至该预测模型中并直接得出样品中某种待测细菌的相对含量。本方法降低了单独使用qPCR进行细菌相对含量检测实验优化的复杂度和操作的繁琐，提高了样品检测得到最终结果的速度；具有极大市场前景和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测样品菌种相对含量的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测样品菌种相对含量的方法。
技术介绍
DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。1977年Sanger专利技术了具有里程碑意义的末端终止测序法(一代测序)。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能满足研究的需要。费用更低、通量更高、速度更快的第二代测序技术应运而生。二代测序的基本原理是边合成边测序，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphaTris-EDTA，脱氧核糖核苷三磷酸，PCR反应体系中合成DNA的必要成分)进行PCR(聚合酶链式反应)，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。qPCR(也称RT-PCR，RealtimeFluorescenceQuantitativePCR，实时荧光定量PCR)，该技术在1996年由美国AppliedBiosysTris-EDTAms公司推出，是一种新型的定量试验技术，它通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，通过建立标准曲线，可计算待测样品模板的初始浓度。单独利用qPCR的方法计算样品中某一特定种类细菌在所有细菌中的含量占比一般可以采用下述两个方法：1、标准曲线法：通过使用标准品和特异性引物和通用引物分别建立待测种类细菌和细菌门(所有细菌种类合集)的标准曲线，并计算出各自的标准曲线公式。然后对待测样品使用上述两对引物进行qPCR的扩增并得出两个反应各自的Ct值，然后把Ct值代入标准曲线公式，推算出该样品中待测种类细菌和总体细菌的绝对数量，最后用公式“待测种类细菌绝对数量/总体细菌绝对数量”计算出该样品中待测种类细菌所占总细菌数的比值或称相对含量。该方法操作繁琐，为了解决每个批次间反应扩增效率不一致的问题，需要对每批次的扩增样品都重新建立上述两条标准曲线，不仅占用了多个反应位置，降低了反应通量，而且标准曲线的建立需要更精确的操作，增加了额外的操作时间和出错的概率。2、2-ΔΔCt法：由于只是为了测定待测种类细菌占总体细菌的相对含量，因此可以跳过计算绝对数量这一步骤，直接将样品的Ct值代入公式“2-[待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值]”计算待测种类细菌所占总细菌数的含量。该方法较标准曲线法虽然大大减少了额外的反应占用仪器上反应孔的数量，提高了反应的通量。但是此法不仅需要增加一个内参基因的扩增而且要求样品所有基因的扩增效率相等且需要接近100％，因此反应优化十分复杂，很多靶基因由于需要特定引物或特定的PCR反应条件，其扩增效率往往并不能够达到如此高的要求，而且要使各个反应的扩增效率相等更是难以优化。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于简化现有技术的繁琐，从而提出一种检测样品菌种相对含量的方法。为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种检测样品菌种相对含量的方法，所述方法步骤如下：1)引物的设计：根据待测菌的16SrRNA或其他靶基因片段设计引物；2)基因组的提取：对菌种样本预处理，并进行低温保存；将预处理后的样本进行初步的离心处理，再进行物理破碎处理，进行冻融酶解处理，接下来进行萃取处理，DNA过柱纯化，最后进行DNA质量检测；3)荧光定量PCR：设置荧光阈值、基线和PCR反应条件，测量得到样品的Ct值原始数据；4)NGS16S测序：使用通用引物扩增出样品中所有细菌的16S，建库并测序；5)NGS分析：载入测序数据文件；去除测序和PCR的错误数据；合并同类项；提取数据；对齐数据；预分簇；剔除嵌合体；与数据库对比并聚类；输出分析结果；对样品中的16S进行归类分析；6)预测模型的建立：将样品NGS的分析结果与样品的Ct值进行关联，运用相关编程和数学工具建立拟合模型，用于计算qPCR实验原始数据并得出最终待测菌相对含量的结果。优选的，所述初步的离心处理步骤为：将样本预处理后的离心管，进行短暂的离心处理：速度为4000rpm，时间为30s，使样本处于离心管的底部；在离心管中加入1000ul的10×Tris-EDTA；漩涡震荡使样本混匀成悬浮液。优选的，所述物理破碎的步骤为：将含有样品的离心管，在12000rpm的速度下进行离心5min，去上清；在每个离心管中加入酸洗玻璃珠；加入900ul的TENS裂解液，震荡混匀；将样品离心管对称放置于组织破碎仪中进行破碎处理，频率为50HZ，时间为10min。优选的，所述冻融酶解处理的步骤为：将经破碎处理后的样品离心管，低速离心5s；将放有样品管的浮漂置65℃的液氮水浴冻融15min；冻融结束后，低速离心5s，加入10ul溶菌酶，震荡混匀置浮漂中，37℃温育1h；取出样品管，加入225ul10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；取出样品管，加入225ul10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min。优选的，所述萃取处理的步骤为：将温育完的样品离心管从水浴锅或金属浴中取出，放入已预冷至4℃的离心机中离心，离心速度为14000rpm，时间为5min，离心后将得到的上清液转移至离心管中；在加入上清液的管中加入浓度为10ng/uL的RNase10uL，在14000rpm的速度下离心处理5min得到新的离心液；再取得到的上清液至新的离心管中；加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；然后在4℃的温度下进行离心处理，离心处理的速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；然后在4℃的温度下离心处理，速度为12000rpm，时间后10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇溶液，漩涡震荡混匀；最后再在4℃的温度下离心处理，速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分两层，将上层液体转移至新的离心管中。优选的，所述DNA过柱纯化的步骤为：取离心管进行离心处理，速度为14000rpm，时间为30min；离心后，若沉淀目视可见，则吸走全部的上清液，并丢弃；若未见沉淀，则小心吸取上清液；然后加入100uLElutionBuffer，漩涡震荡，直至沉淀溶解，得到DNA溶液；在DNA溶液中加入500uLBindingBuffer，5uLNaAc，振荡10s，短暂离心5s，使管盖和管内壁处无液体；将离心管中液体全部转移至DNA分离吸附柱中，静置5min；将DNA分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uLWashingBuffer，静置1min；然后再次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uLWashingBuffer，静置1min；然后第三次进行分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品菌种相对含量的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：1)引物的设计：根据待测菌的16S rRNA或其他靶基因片段设计引物；2)基因组的提取：对菌种样本预处理，并进行低温保存；将预处理后的样本进行初步的离心处理，再进行物理破碎处理，进行冻融酶解处理，接下来进行萃取处理，DNA过柱纯化，最后进行DNA质量检测；3)荧光定量PCR：设置荧光阈值、基线和PCR反应条件，测量得到样品的Ct值原始数据；4)NGS16S测序：使用通用引物扩增出样品中所有细菌的16S，建库并测序；5)NGS分析：载入测序数据文件；去除测序和PCR的错误数据；合并同类项；提取数据；对齐数据；预分簇；剔除嵌合体；与数据库对比并聚类；输出分析结果；对样品中的16S进行归类分析；6)预测模型的建立：将样品NGS的分析结果与样品的Ct值进行关联，运用相关编程和数学工具建立拟合模型，用于计算qPCR实验原始数据并得出最终待测菌相对含量的结果。

【技术特征摘要】
1.一种检测样品菌种相对含量的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：1)引物的设计：根据待测菌的16SrRNA或其他靶基因片段设计引物；2)基因组的提取：对菌种样本预处理，并进行低温保存；将预处理后的样本进行初步的离心处理，再进行物理破碎处理，进行冻融酶解处理，接下来进行萃取处理，DNA过柱纯化，最后进行DNA质量检测；3)荧光定量PCR：设置荧光阈值、基线和PCR反应条件，测量得到样品的Ct值原始数据；4)NGS16S测序：使用通用引物扩增出样品中所有细菌的16S，建库并测序；5)NGS分析：载入测序数据文件；去除测序和PCR的错误数据；合并同类项；提取数据；对齐数据；预分簇；剔除嵌合体；与数据库对比并聚类；输出分析结果；对样品中的16S进行归类分析；6)预测模型的建立：将样品NGS的分析结果与样品的Ct值进行关联，运用相关编程和数学工具建立拟合模型，用于计算qPCR实验原始数据并得出最终待测菌相对含量的结果。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初步的离心处理步骤为：将样本预处理后的离心管，进行短暂的离心处理：速度为4000rpm，时间为30s，使样本处于离心管的底部；在离心管中加入1000ul的10×Tris-EDTA；漩涡震荡使样本混匀成悬浮液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述物理破碎的步骤为：将含有样品的离心管，在12000rpm的速度下进行离心5min，去上清；在每个离心管中加入酸洗玻璃珠；加入900ul的TENS裂解液，震荡混匀；将样品离心管对称放置于组织破碎仪中进行破碎处理，频率为50HZ，时间为10min。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述冻融酶解处理的步骤为：将经破碎处理后的样品离心管，低速离心5s；将放有样品管的浮漂置65℃的液氮水浴冻融15min；冻融结束后，低速离心5s，加入10ul溶菌酶，震荡混匀置浮漂中，37℃温育1h；取出样品管，加入225ul10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；取出样品管，加入225ul10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述萃取处理的步骤为：将温育完的样品离心管从水浴锅或金属浴中取出，放入已预冷至4℃的离心机中离心，离心速度为14000rpm，时间为5min，离心后将得到的上清液转移至离心管中；在加入上清液的管中加入浓度为10ng/uL的RNase10uL，在14000rpm的速度下离心处理5min得到新的离心液；再取得到的上清液至新的离心管中；加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀；然后在4℃的温度下进行离心处理，离心处理的速度为12000rpm，时间为10min；离心后离心管中液体分三层，将上层液体转移至新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚溶液，漩涡震荡混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃俊杰，付志聪，窦浩宇，杨仁涛，
申请(专利权)人：深圳谱元科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44