一种微生态定量检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及微生态定量检测方法及其应用，方法包括：收集微生物检测数据；对样本都以基因为单位，在序列水平上进行聚类；根据聚类结果得到每个基因的多个同源序列的聚类簇；通过生物学分析，将每个目标微生物对应到一个或多个聚类簇的组合；对选取的目标微生物，将其对应的单个或多个求并集的聚类簇进行保守区检索和特异性评估；对具有特异性的保守区进行成对组合，并设计引物；对成功设计引物的保守区对进行基因序列的人工合成，按照设定的不同浓度梯度，制作成阳性质控标准品，并绘制标准曲线；可以对绝大多数的目标微生物进行检测试剂、检测试剂盒、检测仪器的开发，能将众多微生态领域中复杂的科研发现，快速转化成检测产品。品。品。

【技术实现步骤摘要】
一种微生态定量检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，更具体地说，涉及一种微生态定量检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]微生物在地球上是无处不在，影响着整个生物圈，它们在调节我们星球上几乎所有环境中生物地球化学系统中起着主要作用，包括一些最极端的环境，从冰冻环境和酸性湖泊，到深海底部的热泉喷口，也包括一些人类最熟悉的环境，如人体肠道、口腔、生殖道、皮肤等。在自然环境中，微生物往往不是以单一种类的形式而存在，为了更好地适应环境、延续生命，它们一方面要通过不同种类微生物在基因代谢通路上的互补合作，另一方面也存在微进化过程从而使得单一菌株会不断变异产生多个菌株的混合群落。这种混合群落被称作微生态，也有叫作微生物群落、菌群、微生物组等。
[0003]最被人类熟知，也最为重要的微生态是人体肠道微生态。在人肠道内部存在着大量共生微生物，并通过多种途径影响人体健康，尤其是各种代谢物在人体的健康促进和疾病发生、发展中起着重要作用。肠道微生态研究发现，糖尿病、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、肥胖、抑郁症等疾病均与肠道微生态相关，最新研究发现阿尔兹海默症或与肠道微生物有关，肠道微生态平衡正成为人体健康的重要标志。维持肠道微生态的动态平衡，有助于人体抵御各种疾病的干扰，保持健康状态，维持肠道微生态的平衡主要是维持肠道菌群的数量保持在稳定健康数值范围内。为了更好地通过肠道微生态来预知疾病风险，针对特定种类的微生物检测就尤为需要。
[0004]肠道微生态是动态的，能被多种因素改变，例如饮食习惯、运动、药物、肠菌移植治疗等，还包括近年来在健康医疗领域热门的益生菌、益生元、后生元等功能性食品。什么样的肠道微生态是需要主动去干预和改变的？改变到什么状态是健康需要的？种种这些问题都说明肠道微生态检测是此方向下医疗和健康管理行为的基石。目前，全球普遍采用的微生态定量检测方法为细菌16S rRNA基因的测序、宏基因组测序、微生物产物检测等。但这些方法不是检测成本较高、操作复杂，就是检测内容单一、覆盖面窄，都不能符合医疗健康领域对微生态的检测需求。肠道微生态检测，作为全球研究投入最大的微生态领域都尚且如此，其它环境的微生态检测更是缺乏一种方便快捷、专业有效、成本可及的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种微生态定量检测方法，还提供了一种微生态定量检测方法的应用。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]构造一种微生态定量检测方法，其中，包括以下步骤：
[0008]第一步：针对需要检测的微生态环境，收集一个或多个样本的微生物检测数据；
[0009]第二步：对收集的样本都以基因为单位，在序列水平上进行聚类；
[0010]第三步：根据聚类结果得到每个基因的多个同源序列的聚类簇；
[0011]第四步：通过生物学分析，将每个目标微生物对应到一个或多个聚类簇的组合；
[0012]第五步：对选取的目标微生物，将其对应的单个或多个求并集的聚类簇进行保守区检索和特异性评估；对具有特异性的保守区进行成对组合，并设计引物；
[0013]第六步：对成功设计引物的保守区对进行基因序列的人工合成，按照设定的不同浓度梯度，制作成阳性质控标准品，并绘制标准曲线。
[0014]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述第五步中引物设计处理包括方法：
[0015]将选取的目标微生物的全部基因序列进行多序列比对；
[0016]在多序列比对结果中寻找保守区，保守区长度在18bp以上；
[0017]将所有找出的保守区两两组合成保守区对，每一组保守区对中两个保守区相距80～400bp；
[0018]依次将每个保守区对中所包含序列在第三步中的所有基因的全部序列集合中进行相似性比对，通过比对结果过滤掉特异性不符合设定阈值的保守区对；
[0019]对通过过滤的保守区对的序列上进行引物设计。
[0020]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述第五步中引物设计处理还包括方法；
[0021]如果不存在通过过滤的保守区对或者通过过滤的保守区对无法成功设计引物，则认为当前所用的聚类簇不通过的，选取下一个聚类簇来重复引物设计处理；
[0022]如果所有的聚类簇都没有能成功设计引物，则认为选取的目标微生物是难以被单一引物靶标进行检测的，按照设定处理方法进行处理。
[0023]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述设定处理方法包括：
[0024]方法终止或跳转至第四步重新选择或定义选取的目标微生物同序列基因簇的对应关系。
[0025]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述设定处理方法包括：
[0026]放宽保守区的定义标准、放宽对保守区特异性进行过滤的标准或放宽对引物灵敏度和特异度的要求后，重新进行引物设计处理。
[0027]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述第五步还包括方法：
[0028]进行引物灵敏度和特异度的生物信息学评估，当灵敏度和特异度都能被接受时，则认为该目标微生物的引物设计成功；
[0029]引物灵敏度是指引物序列对目标微生物内部全部序列的覆盖度；引物特异度是指引物序列能覆盖的第三步中所有基因的全部序列中来自于目标微生物的比例。
[0030]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述第一步中，所述微生物检测数据包括宏基因组测序数据和/或基因靶向测序数据。
[0031]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述四步中，所述生物学分析方法包括：通过物种分类进行直接对应、基因功能来对应或由基因序列簇谱和样本表型信息谱进行关联分析得到基因序列簇。
[0032]本专利技术所述的微生态定量检测方法，其中，所述第六步中，还包括方法：
[0033]将阳性质控标准品的实际扩增结果进行拟合，得到绝对定量值Y，公式如下：Y＝aX+b，其中X为PCR扩增Ct值，a和b为阳性质控标准品实际检测数据的拟合结果。
[0034]一种微生态定量检测方法的应用，其中，如上述的微生态定量检测方法在人肠道微生态和/或生殖道微生态检测中的应用。
[0035]一种人肠道微生态试剂，其中，所述试剂中的阳性质控标准品由如上述的微生态定量检测方法制成。
[0036]一种生殖道微生态检测试剂，其中，所述试剂中的阳性质控标准品由如上述的微生态定量检测方法制成。
[0037]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提出了一种可适用于各类微生态样本的微生物定量检测方法，采用本专利技术方法，可以对绝大多数的目标微生物进行检测试剂、检测试剂盒、检测仪器的开发，能将众多微生态领域中复杂的科研发现，快速转化成检测产品，应用于医疗、健康管理、药物、食品营养、环境保护等日常生活的方方面面；本专利技术所述方法，还可进一步拓展到非微生态靶标的检测，例如人、动物、植物的基因检测中。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生态定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：针对需要检测的微生态环境，收集一个或多个样本的微生物检测数据；第二步：对收集的样本都以基因为单位，在序列水平上进行聚类；第三步：根据聚类结果得到每个基因的多个同源序列的聚类簇；第四步：通过生物学分析，将每个目标微生物对应到一个或多个聚类簇的组合；第五步：对选取的目标微生物，将其对应的单个或多个求并集的聚类簇进行保守区检索和特异性评估；对具有特异性的保守区进行成对组合，并设计引物；第六步：对成功设计引物的保守区对进行基因序列的人工合成，按照设定的不同浓度梯度，制作成阳性质控标准品。2.根据权利要求1所述的微生态定量检测方法，其特征在于，所述第五步中引物设计处理包括方法：将选取的目标微生物的全部基因序列进行多序列比对；在多序列比对结果中寻找保守区，保守区长度在18bp以上；将所有找出的保守区两两组合成保守区对，每一组保守区对中两个保守区相距80～400bp；依次将每个保守区对中所包含序列在第三步中的所有基因的全部序列集合中进行相似性比对，通过比对结果过滤掉特异性不符合设定阈值的保守区对；对通过过滤的保守区对的序列上进行引物设计。3.根据权利要求2所述的微生态定量检测方法，其特征在于，所述第五步中引物设计处理还包括方法；如果不存在通过过滤的保守区对或者通过过滤的保守区对无法成功设计引物，则认为当前所用的聚类簇不通过的，选取下一个聚类簇来重复引物设计处理；如果所有的聚类簇都没有能成功设计引物，则认为选取的目标微生物是难以被单一引物靶标进行检测的，按照设定处理方法进行处理。4.根据权利要求3所述的微生态定量检测方法，其特征在于，所述设定处理方法包括：方法终止或跳转至第四步重新选择或定义选取的目标微生物同序列基因簇的对应关系。5.根据权利要求3所述的微生态定量检测方法，其特征在于，所述设定处理方法包括：放宽保守区的定义标准、放...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃俊杰，徐军明，黄晴茹，
申请(专利权)人：深圳谱元科技有限公司，
类型：发明
国别省市：