一种新型病原微生物检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种新型病原微生物检测的方法，包括：脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤；外周血样本采集步骤；DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂buffer GB、Lysis Enzyme K、RNA Carrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用Illumina SBS测序方法读取序列，获得测序数据；分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对。

A new detection method of pathogenic microorganism

The invention discloses a new method for detection of pathogenic microorganism, which includes: collection steps of cerebrospinal fluid and alveolar lavage fluid samples; collection steps of peripheral blood samples; DNA extraction steps, taking 400ul samples for detection, adding reaction reagents buffer GB, lysis enzyme K, RNA carrier in the samples, reacting at 56 \u2103 for 10min to obtain reaction liquid; the reaction liquid is pure through silica gel membrane adsorption column In the sequencing step, the library is transformed into a single strand by NaOH, and then combined to the sequencing chip. Each single strand DNA molecule is enriched into a single strand by bridge amplification Cluster, read the sequence by Illumina SBS sequencing method, and obtain the sequencing data; analysis step, the sequencing data is filtered by data, remove the human source and connector sequence, and the remaining data is compared with the microbial reference database.

【技术实现步骤摘要】
一种新型病原微生物检测的方法
本专利技术涉及分子生物学和分子遗传学领域，尤其涉及基于新一代测序技术的一种新型病原微生物检测的方法。
技术介绍
传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类：基于细胞培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等，和基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足，如前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低，后者需要一定的微生物序列先验知识、无法应对未知或突变病原体等。因此，病原微生物基因组测序逐渐成为临床微生物检测领域的重要工具与手段，但是，当前对于病原微生物的检测方法比较匮乏，难以准确检测样本中微生物的种类。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在加深对本专利技术的总体
技术介绍
的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。基于上述原因，本申请人提出了一种新型病原微生物检测的方法，旨在克服上述问题，检测血液、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液等样本，可准确检测样本中微生物的种类。
技术实现思路
为了满足上述要求，本专利技术的的在于提供一种新型病原微生物检测的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种新型病原微生物检测的方法，包括：脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤，使用2ml或5ml无菌冻存管收集样本，干冰保存，所述样本量大于1ml；外周血样本采集步骤，使用EDTA抗凝管或STRECK采血管收集外周血5ml，生物冰袋或4℃以下保存，8h内分离血浆，实施检测前进行血浆分离流程；DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂bufferGB、LysisEnzymeK、RNACarrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用IlluminaSBS测序方法读取序列，获得测序数据；分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对，鉴定出样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫微生物。本专利技术的检测方法主要用于提取脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、血浆、胸腹水等样本中循环游离DNA，并直接对提取的DNA进行建库，分析其中可能的病原微生物。进一步技术方案为，所述脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤与外周血样本采集步骤还包括以下样品保存方法：步骤a.除RNACarrier外，其余试剂在15-25℃干燥条件下；或，保存于4-8℃条件下，使用前在室温放置以溶解沉淀；步骤b.RNACarrier，浓度为1ug/ul，采用分装处理，保存温度为-20℃，反复冻融次数不超过三次；步骤c.试剂所需的缓冲液GD、漂洗液PW使用前加入无水乙醇；步骤d.避免试剂的反复冻融；步骤e.将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用移液器定时实验区域进行清洁；步骤f.所述血浆分离流程过程中，加入样本涡旋后均对样本进行短暂离心，以离心管壁上的残余液体；步骤g.PCR反应管从PCR仪器中拿下后，短暂离心处理，用于将管壁和管盖上的液体离心到管底。进一步技术方案为，所述血浆分离流程包括：高速冷冻离心机预冷至4℃；将含全血样本的2ml离心管，置预冷离心机1600g离心10min；离心后将所述离心管中的上清转移至新的无菌2ml离心管中，使用离心机进行16000g离心10min；离心结束后将所述上清转移至新的无菌2ml离心管中，取400ul用于检测，剩余样本-80℃冻存。所述DNA提取采用的是化学裂解及酶解法，原始样本如脑脊液等经bufferGB及LysisEnzymeK裂解消化后，经硅胶膜吸附柱纯化，得到总量、纯度符合要求的DNA。所述文库构建步骤中，文库构建具体又分为以下几步：末端修复：提取后所得到的DNA由于可能存在末端不齐及链损伤的情况，需经末端修复后将双链DNA末端补平并且修复链损伤。防止影响后续反应的成功率；此反应所需的试剂为5ulEndPrepEnzyme及5ulEndPrepBuffer，酶作用时间及酶失活时间均为30min；接头连接：经末端修复后的DNA可与接头(Adapter)在LigationMix及LigationEnhancer共同作用下发生连接反应；各试剂详细用量为：adapter用量2ul；LigationMix用量30ul；LigationEnhancer用量1ul，反应试剂及DNA混合后反应时间为15min；连接后纯化：连接产物需经AMPureXPbeads纯化后进行PCR富集；具体纯化操作步骤为：连接产物与50ul磁珠混合后，室温条件下磁珠可将连接后的DNA吸附，磁珠经磁力架吸附后即可将剩余组分去除，使用80％无水乙醇洗两次即可洗脱得到无接头、酶、其他盐离子及有机试剂污染的纯度较高的连接产物。文库富集：连接产物在引物、脱氧核糖核酸(ddNTP)、HiFi扩增酶作用下，可进行PCR扩增，得到总量较高的文库；文库纯化及质控：PCR富集后文库经AMPureXPbeads纯化后即可检测。取1ul用于Qubit核酸浓度测定；取2ul用于琼脂糖凝胶电泳检测确定文库片段大小；测序及分析：文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，再用IlluminaSBS测序方法读取序列。测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对，即可鉴定出样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫等微生物。相比于现有技术,本专利技术的有益效果在于：采用本方案的检测方法，可准确检测样本中目前已知的包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等数十万种微生物此外，样本保存的方法保证了样本的可靠性，对于样本进行分离处理的流程，确保了样本检测的准确性，实现了达到精确检测的目的。下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步描述。附图说明图1是本专利技术一种新型病原微生物检测的方法的文库构建流程示意图；图2是本专利技术一种新型病原微生物检测的方法的具体实施例中实施例一血浆样本B1的文库构建琼脂糖凝胶电泳结果；图3是本专利技术一种新型病原微生物检测的方法的具体实施例中实施例一血浆样本B1的病原微生物检测结果；图4是本专利技术一种新型病原微生物检测的方法的具体实施例中实施例二的脑脊液样本CF1及血浆样本B2文库构建琼脂糖凝胶电泳结果；图5是本专利技术一种新型病原微生物检测的方法的具体实施例中实施例二脑脊液样本CF1的病原微生物检测结果；图6是本专利技术一种新型病原微生物检测的方法的具体实施例中实施例二血浆样本B2的病原微生物检测结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型病原微生物检测的方法，其特征在于，包括：脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤，使用2ml或5ml无菌冻存管收集样本，干冰保存，所述样本量大于1ml；外周血样本采集步骤，使用EDTA抗凝管或STRECK采血管收集外周血5ml，生物冰袋或4℃以下保存，8h内分离血浆，实施检测前进行血浆分离流程；DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂buffer GB、Lysis Enzyme K、RNA Carrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用Illumina SBS测序方法读取序列，获得测序数据；分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对，鉴定出样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫微生物。

【技术特征摘要】
1.一种新型病原微生物检测的方法，其特征在于，包括：脑脊液、肺泡灌洗液类样本收集步骤，使用2ml或5ml无菌冻存管收集样本，干冰保存，所述样本量大于1ml；外周血样本采集步骤，使用EDTA抗凝管或STRECK采血管收集外周血5ml，生物冰袋或4℃以下保存，8h内分离血浆，实施检测前进行血浆分离流程；DNA提取步骤，取400ul样本用于检测，样本中加入反应试剂bufferGB、LysisEnzymeK、RNACarrier，56℃下反应10min，获得反应液；反应液经硅胶膜吸附柱纯化，去除盐离子及有机试剂，得到总量、纯度符合要求的DNA；文库构建步骤，所述DNA由末端修复、接头连接、文库扩增富集、纯化、质控步骤处理，完成文库构建；测序步骤，文库经NaOH变性为单链后，结合到测序芯片上，经桥式扩增将每个单链DNA分子富集成为一个cluster，利用IlluminaSBS测序方法读取序列，获得测序数据；分析步骤，所述测序数据经数据过滤、去除人源及接头序列，剩余数据与微生物参考数据库比对，鉴定出样本中的细菌、真菌、病毒、寄生虫微生物。2.根据权利要求1所述的一种新型病原微生物检测的方法，其特征在于，所述脑脊液、肺泡灌...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃俊杰，
申请(专利权)人：深圳谱元科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44