基于LuxR蛋白结构进行群体感应抑制剂的筛选方法技术

本发明专利技术公开了基于LuxR蛋白结构进行群体感应抑制剂的筛选方法，首先找到可用于三维结构预测的氨基酸序列；其次对预测模型进行评价打分及模型优化，使其合格；再通过Maestro软件虚拟筛选出与LuxR匹配度高、靶向性强的小分子化合物。本发明专利技术不仅为未找到公开晶体结构的靶蛋白进行建模提供了思路，同时也为由单一建模方法构建的模型不合格提供了有价值的参考方向；此外，通过虚拟筛选技术能更全面更准确地筛选出具有高生物活性的群体感应抑制剂，该方法极大地节省了筛选时间、人力物力成本，降低了筛选的盲目性和偶然性。降低了筛选的盲目性和偶然性。

【技术实现步骤摘要】
基于LuxR蛋白结构进行群体感应抑制剂的筛选方法


[0001]本专利技术公开了一种靶向LuxR蛋白、基于分子对接及Maestro虚拟筛选技术来筛选LuxR型群体感应抑制剂前的蛋白准备新方法，虚拟筛选选择的小分子化合物库涵盖种类丰富，可以用于从天然产物、药食同源、食物源组分、食品添加剂及先导化合物等库中进行高生物活性抑制剂的高通量精准筛选。

技术介绍

[0002]水产品中的特定腐败菌它能够在低温环境下生长繁殖并产生极耐热的蛋白酶和脂肪酶，引起食品腐败变质，还会威胁冷链食品的食品安全。已有研究表明多种造成食品腐败的细菌是由于其自身的群体感应(Quorum Sensing，QS)系统在起作用，之所以能调控食品腐败是因为其参与调控了蛋白质分解酶、脂肪分解酶、果胶分解酶、壳多糖分解酶等食品腐败相关分解酶的活性，且不同种类的QS信号分子调控不同的表型特征。细菌通过监测自身细胞密度变化来调控特定基因表达的机制即群体感应现象，细菌能通过QS系统参与细菌间信息交流，并调控细菌多重生理表型，如孢子和生物被膜的生成，毒素的分泌，抗生素的产生等。基于此，寻找有效的群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitor,QSI)来干扰群体感应系统可能是控制腐败菌致腐的可能途径。
[0003]近年来，探究QS现象与食品品质的关系以及调控食品腐败的机理机制已经成为食品防腐保鲜领域的一个研究热点；与此同时，寻找和发现新的QSIs也成为与其并驾齐驱的新的研究热点，如今已有多种物质在不同水产品来源被证明具有群体感应抑制活性。目前，常用的群体感应抑制剂筛选方法有指示菌株法、生物传感器法、动物模型法、电泳中介微分析法、发光法及利用自杀基因快速鉴定等。曾名湧等人进行的指示菌株法和生物传感器法需首先将海藻干燥粉碎后加入乙醇溶液进行提取，然后将提取液用生物传感器紫色杆菌CV026和信号分子AHLs进行检测，检测结果为阳性的提取液即为细菌群体感应抑制剂，该方法的筛选结果假阳性较高；动物模型法需要较为繁琐的实验步骤和较高的成本，且实验偶然性较大，不易控制；岳美娥等人进行的电泳中介微分析是在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外210nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选，该方法主要是一种酶抑制剂筛选方法，可选择范围受限。林向民等人进行的发光法和自杀基因快速鉴定法均操作简单，一般只需三天到一周左右时间就可获得多个QSI候选多肽。
[0004]但从目前的报道来看，有各类基于分子对接进行虚拟筛选抑制剂的方法，但却没有关于靶蛋白晶体结构未在RCSB PDB数据库中公开或通过SWISS
‑
MODEL建模后质量不合格如何获得靶蛋白的模拟结构的解决办法；此外，当前报道进行虚拟筛选的库大多为ZINC或传统中药数据库，而鲜有从涵盖小分子化合物种类更广、结构更新、生物活性更高的新库中进行群体感应抑制剂筛选的报道。因此，对于靶蛋白晶体结构未在RCSB PDB数据库中公开或通过SWISS
‑
MODEL建模后质量不合格的靶蛋白，通过I
‑
TASSER进行从头预测，然后通过ModRefiner进行原子细化是一种可供借鉴的建模思路，然后通过Maestro辅助从新的更全面的活性化合物新库，如Life Chemicals 50K Diversity Library(含50.2K
个化合物)、MCE Bioactive Compound Library Plus(含12.6K个化合物)中进行群体感应抑制剂的虚拟筛选，这将一方面为未找到公开晶体结构的靶蛋白进行建模提供了思路，同时也为由单一建模方法构建的模型不合格提供了有价值的参考方向；另一方面，通过计算机虚拟筛选技术能高效筛选出匹配度高，靶向性强，具有潜力的的群体感应抑制剂，极大地节省了筛选时间、人力物力成本，降低了筛选的盲目性和偶然性，能广泛应用于水产食品防腐和保鲜等方面，为探究群体感应在食品腐败中的机制，构建以干扰群体感应系统作为新靶点的食品防腐保鲜策略提供理论依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种基于LuxR蛋白结构进行群体感应抑制剂的筛选方法，是基于分子对接，靶向LuxR蛋白虚拟筛选抑制剂前的蛋白准备新方法，为了说明一种靶蛋白没有晶体结构如何获得三维结构的方法以及提出一种当同源建模得出的蛋白结构不合格时的解决思路，之后应用分子对接高效、安全、经济的筛选细菌群体感应抑制剂，本专利技术提供了一种更高效更精准筛选群体感应抑制剂的新思路，基于LuxR蛋白三维结构及基于受体的分子对接技术，通过Maestro11.4软件虚拟筛选的方法以获得具有高生物活性和强群体感应抑制活性的抑制剂，以获得具有高生物活性和强群体感应抑制活性的抑制剂，对于排名靠前的小分子物质进行购买及抑制活性验证，排除假阳性并用于进一步实验。
[0006]本专利技术提供了一种基于LuxR蛋白结构进行群体感应抑制剂的筛选方法，具体步骤包括：
[0007](1)蛋白氨基酸序列的获取：LuxR蛋白的晶体结构未在RCSB PDB数据库中公开，因此我们需要先找到可用于三维结构预测的氨基酸序列，再对该蛋白三维结构进行同源建模。从蜂房哈夫尼菌的基因组数据中得到LuxR蛋白的全长氨基酸序列(246个)，通过Blast序列比对发现了98％
‑
100％匹配(匹配度越高越好)的蛋白，然后根据匹配蛋白的名称和种属到Uniprot网站搜索，最终得到和自己的靶蛋白种类，所属菌属及氨基酸序列长度完全一致的蛋白，下载保存此蛋白氨基酸序列，用于下一步三维结构的预测。
[0008](2)蛋白结构的准备、评价及优化：LuxR蛋白在SWISS
‑
MODEL网站上进行同源建模，同源性为31.75％，蛋白结构质量评价时TM
‑
score得分0.76(TM
‑
score的值区间为(0,1)，其中1表示两个结构完全匹配。根据PDB中结构的严格统计，得分低于0.17的结构对应随机选择的不相关蛋白，而得分高于0.5的结构假设在SCOP/CATH中折叠程度基本相同)、RMSD得分5.0(平均偏差，越低越好)以及QMEAN值为
‑
6.40，QMEAN值超出了置信分数区间[
‑
4,0]，且分数越接近于0值，表明模型质量越好，表明该种预测方式得出的蛋白三维结构局部相对质量和整体质量较差。我们采用另一种算法采用I
‑
TASSER蛋白质结构和功能预测服务器，以TM
‑
score得分、RMSD得分以及QMEAN得分为评价指标，来对LuxR蛋白结构进行从头预测，得出的蛋白结构评价TM
‑
score得分0.76
±
0.10,RMSD为0.10,RMSD为又通过ModRefiner进一步原子细化(能量优化)后，TM
‑
score更高(0.9946)，RMSD更低(0.431)，且拉氏构象图拉氏构象图(主要由有利区域、额外允许区域、一般允许区域以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LuxR蛋白结构进行群体感应抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括步骤：(1)蛋白氨基酸序列的获取：从蜂房哈夫尼菌的基因组数据中得到LuxR蛋白的氨基酸序列，通过Blast序列比对评估匹配的蛋白，然后根据匹配蛋白的名称和种属到Uniprot网站搜索，最终得到和LuxR靶蛋白种类、所属菌属及氨基酸序列长度均完全一致的蛋白，下载保存此蛋白氨基酸序列，用于下一步三维结构的预测；(2)蛋白结构的准备、评价及优化：采用I
‑
TASSER蛋白质结构和功能预测服务器，以TM得分、RMSD得分以及QMEAN得分为评价指标，对步骤(1)中得到的LuxR蛋白氨基酸序列进行同源建模；并通过ModRefiner对蛋白结构进行能量优化，构建三维结构模型；(3)分子对接前的蛋白准备及结合位点预测：通过Maestro软件中Protein Preparation Wizard模块对步骤(2)得到的LuxR蛋白进行加氢，删除水分子，修补缺失残基、侧链；随后进行能量优化；将处理好的蛋白用sitemap模块对蛋白进行结合位点预测，然后将处理好的蛋白用Receptor Grid Generation模块制作格点文件，以LuxR与Furanone C_30结合的口袋为中心生成格点文件；(4)小分子化合物准备：将化合物数据库中化合物的2D格式通过软件LigPrep Module模块进行加氢、能量优化处理，输出3D结构以进行虚拟筛选；其中，化合物的数据库为Life Chemicals 50K Diversity Library及MCE Bioactive Compound Library Plus；(5)分子对接：采用Virtual Screening Workflow模块进行虚拟筛选，将步骤(4)中准备好的化合物导入，先利用Glide模块将Life Chemicals 50K Diversity Library中的化合物与步骤(3)中得到的LuxR靶蛋白进行分子对接：首先采用Glide模块中的高通量筛选模式将Life Chemicals 50K Diversity Library中的准备好的小分子化合物进行第一轮筛选，获得由高到低的第一轮小分子化合物的排名；挑选第一轮小分子化合物排名中打分值前20％的小分子化合物采用标准模式进行第二轮筛选，获得由高到低的第二轮小分子化合物的排名；随后挑选第二轮小分子化合物的排名中打分值前20％的小分子化合物采用高精度模式进行第三轮筛选，获得由高到低的第三轮小分子化合物的排名；采用同样的方法，将MCE Bioactive Compound Library Plus中的化合物与靶蛋白进行分子对接：首先采用Glide模块中的高通量筛选MCE Bioactive Compou...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯红漫，李雪，闫丛阳，毕景然，张公亮，郝洪顺，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：