生物分子三维动态分析方法和系统技术方案

本发明专利技术适用于生物分子动态分析技术领域，提供了一种生物分子三维动态分析方法和系统，包括脉冲激光器，双色镜，物镜，分束镜，成像透镜，门控探测器，光程调节装置，焦面调节装置以及时间同步装置，控制脉冲激光器和所控探测器同步开放。该系统通过两路荧光光路的光程差对应的时间、反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过反射荧光信号和透射荧光信号的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。本发明专利技术集荧光寿命检测和三维定位于一体，在高精度三维定位的同时能够获知微环境的变化，为细胞内分子动态研究提供了更加有利的支持，并且该系统结构简单紧凑，可靠性更好。

【技术实现步骤摘要】
生物分子三维动态分析方法和系统
本专利技术属于细胞动态分析
，特别涉及一种生物分子三维动态分析方法和系统。
技术介绍
细胞内的蛋白质大分子往往是在复杂的运输网络的协调下运动到细胞内的不同位置。例如,细胞内吞首先从细胞膜开始,货物分子与细胞膜表面的受体分子结合后，通过特定的机制(例如网格蛋白小窝、cpp)被摄入细胞，然后被运送到细胞深处的内体室。对于细胞内生物学过程的追踪这一领域，我们目前的研究方法和手段还十分有限。对于细胞动态过程研究，常用的一种分析工具是单粒子/分子追踪(SingleParticleTracking,SPT)。SPT通过对单个分子信号进行分析，从而获得其纳米精度的位置信息。目前，利用宽场显微镜便可实现单分子的二维或者三维追踪。随着单分子显微技术的诞生，许多生物学家对于细胞内单个分子的运输路径产生浓厚的兴趣。SPT克服了传统群体分子研究时带来的平均效应，从而可以提供传统群体分子研究无法获取的信息。当要研究成分组成复杂的系统(例如研究货物分子从质膜到核内体的运输途径)时，这些细节信息就会变得尤为重要。鉴于SPT的这些优越性，在过去二十年里，利用SPT方法开展的各种生物学应用也急剧增加。例如，利用SPT已经揭示了细胞质膜分子组织的新的动力学信息。SPT的发展非常迅速，当前的SPT的方法研究工作主要集中在获得精确的三维运动轨迹，不足之处在于，在这一运动过程中微环境的变化仍缺乏有效的分析手段。但微环境(例如PH值、粘滞度等)的变化却恰恰是影响囊泡和蛋白运动的重要因素，因此微环境的变化信息也尤为重要，目前的SPT技术在获得运动过程中局部微环境变化方面还存在技术缺口。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物分子三维动态分析系统，旨在解决传统技术在进行分子三维纳米精度定位时不能获知分子所处微环境的变化信息的技术问题。本专利技术是这样实现的，生物分子三维动态分析系统，包括脉冲激光器，用于发射脉冲激光；双色镜，设置于所述脉冲激光器的输出光路上，用于向样品反射脉冲激光并透射样品产生的荧光；物镜，设置于所述双色镜的反射光路上，用于将所述脉冲激光投射于所述样品上，收集所述样品产生的荧光并将所述荧光向所述双色镜输出；分束镜，设置于所述双色镜的透射光路上，用于将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；成像透镜，设置于所述反射荧光和透射荧光的光路上；门控探测器，设置于所述成像透镜的输出光路上，用于探测反射荧光信号和透射荧光信号；光程调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于控制反射荧光光路和透射荧光光路的光程差；焦面调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于使反射荧光光路和透射荧光光路对应的焦平面错位；时间同步装置，设置于所述脉冲激光器和所述门控探测器之间，用于控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；所述生物分子三维动态分析系统通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。进一步地，生物分子三维动态分析系统还包括光束调整装置，设置于所述脉冲激光器和所述双色镜之间，用于准直扩束。进一步地，所述脉冲激光器为皮秒脉冲激光器或者飞秒脉冲激光器。进一步地，所述反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间为1～3纳秒。进一步地，所述光程调节装置包括可移动的反射镜组，所述反射镜组包括第一反射镜和第二反射镜，所述第一反射镜设置于所述分束镜的透射方向，所述第二反射镜设置于所述第一反射镜的反射方向，并与所述第一反射镜成90°角相对设置。进一步地，所述第二反射镜和所述成像透镜之间还设有第三反射镜，所述第三反射镜反射的透射荧光与所述反射荧光平行。进一步地，所述焦面调节装置为透镜，设置于所述第三反射镜和所述成像透镜之间。本专利技术还提供一种生物分子三维动态分析方法，包括下述步骤：获取脉冲激光；将所述脉冲激光准直扩束后投射至样品，使所述样品发荧光；将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；调节反射荧光光路和透射荧光光路的光程差，调节所述反射荧光对应的焦面和透射荧光对应的焦面错位；通过门控探测器分别探测所述反射荧光信号和透射荧光信号，且控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。进一步地，所述荧光寿命为其中，τ为荧光寿命，Δt为反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间，I1为光程较短的探测光路的荧光信号强度，I2为光程较长的探测光路的荧光信号强度。进一步地，根据所述反射荧光信号和透射荧光信号的双焦面图像获得分子三维定位信息的步骤具体为：根据反射荧光信号和/或透射荧光信号的亮斑或亮环的位置确定所述分子的横向定位信息；根据所述反射荧光信号和透射荧光信号的亮环直径确定所述分子的轴向定位信息。本专利技术提供的生物分子三维动态分析系统的技术效果如下：一方面，采用脉冲激光器发射脉冲激光，由脉冲激光激发样品产生荧光，通过分束镜将荧光分为两路，且通过光程调节装置使两路荧光具有一定的光程差，由时间同步装置控制门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间，通过门控制探测器探测两路荧光信号的强度，结合两路荧光光路的光程差对应的时间获得荧光寿命；另一方面，通过焦面调节装置使两路荧光对应的焦面错位，形成双焦面成像系统，通过门控探测器获得反射荧光成像和透射荧光成像，将反射荧光成像和透射荧光成像相结合，进行轴向和横向定位，即可获得分子三维定位信息。这样，该系统集荧光寿命检测和三维定位于一体，荧光寿命和分子所在微环境息息相关，因此，该系统在高精度三维定位的同时能够获知微环境的变化，为细胞内分子动态研究提供了更加有利的支持，并且该系统结构简单紧凑，可靠性更好。附图说明图1是本专利技术实施例提供的生物分子三维动态分析系统的结构示意图；图2是本专利技术实施例提供的生物分子三维动态分析系统的反射荧光光路和透射荧光光路的成像示意图；图3是本专利技术实施例提供的生物分子三维动态分析方法的流程图；图4是脉冲激光器和门控探测器的同步控制示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。为了说明本专利技术所述的技术方案，以下结合具体附图及实施例进行详细说明。请参阅图1，本专利技术实施例提供一种生物分子三维动态分析系统，用于对细胞内分子进行定位和荧光寿命检测，以获取细胞内分子的运动状态信息和微环境信息。该系统至少包括如下光学器件：脉冲激光器10、双色镜20、物镜30、分束镜40、成像透镜50、光程调节装置60、焦面调节装置70、时间同步装置80以及门控探测器90。其中，脉冲激光器10，用于发射脉冲激光，该脉冲激光为皮秒级或者飞秒级脉冲激光；双色镜20，设置于脉冲激光的输出光路上，用于将脉冲激光向样品100反射，并透射样品100产生的荧光；物镜30，设置于双色镜20的反射光路上，用于将脉冲激光投射本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生物分子三维动态分析系统，其特征在于，包括脉冲激光器，用于发射脉冲激光；双色镜，设置于所述脉冲激光器的输出光路上，用于向样品反射脉冲激光并透射样品产生的荧光；物镜，设置于所述双色镜的反射光路上，用于将所述脉冲激光投射于所述样品上，收集所述样品产生的荧光并将所述荧光向所述双色镜输出；分束镜，设置于所述双色镜的透射光路上，用于将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；成像透镜，设置于所述反射荧光和透射荧光的光路上；门控探测器，设置于所述成像透镜的输出光路上，用于探测反射荧光信号和透射荧光信号；光程调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于控制反射荧光光路和透射荧光光路的光程差；焦面调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于使反射荧光光路和透射荧光光路对应的焦平面错位；时间同步装置，设置于所述脉冲激光器和所述门控探测器之间，用于控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；所述生物分子三维动态分析系统通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。...

【技术特征摘要】
1.生物分子三维动态分析系统，其特征在于，包括脉冲激光器，用于发射脉冲激光；双色镜，设置于所述脉冲激光器的输出光路上，用于向样品反射脉冲激光并透射样品产生的荧光；物镜，设置于所述双色镜的反射光路上，用于将所述脉冲激光投射于所述样品上，收集所述样品产生的荧光并将所述荧光向所述双色镜输出；分束镜，设置于所述双色镜的透射光路上，用于将所述荧光分束为反射荧光和透射荧光；成像透镜，设置于所述反射荧光和透射荧光的光路上；门控探测器，设置于所述成像透镜的输出光路上，用于探测反射荧光信号和透射荧光信号；光程调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于控制反射荧光光路和透射荧光光路的光程差；焦面调节装置，设置于所述分束镜和所述成像透镜之间的反射荧光光路或透射荧光光路上，用于使反射荧光光路和透射荧光光路对应的焦平面错位；时间同步装置，设置于所述脉冲激光器和所述门控探测器之间，用于控制所述门控探测器开放时刻相对于脉冲激光的延迟时间；所述生物分子三维动态分析系统通过反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间、所述反射荧光信号和透射荧光信号获得荧光寿命，通过所述反射荧光信号和透射荧光信号对应的双焦面图像获得分子动态三维定位信息。2.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，还包括光束调整装置，设置于所述脉冲激光器和所述双色镜之间，用于准直扩束。3.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述脉冲激光器为皮秒脉冲激光器或者飞秒脉冲激光器。4.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述反射荧光光路和透射荧光光路的光程差所对应的时间为1～3纳秒。5.如权利要求1所述的生物分子三维动态分析系统，其特征在于，所述光程调节装置包括可移动的反射镜...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丹妮，李恒，屈军乐，于斌，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44