一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合制造技术

本发明专利技术公开了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法以及相应的引物和探针。本发明专利技术首次建立了一种可快速区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株(WF100株和FX2010‑180P株)的荧光PCR检测方法，该检测方法操作简单，全部操作过程不需3小时，显著缩短了病毒野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

A combination of primers and probes for differentiating wild strains and vaccine strains of duck tembus virus

The invention discloses a method for differentiating wild strains and vaccine strains of duck tembus virus and corresponding primers and probes. For the first time, a fluorescence PCR detection method for the rapid differentiation of duck tanbsu virus wild virus strain and vaccine strain (WF100 strain and FX2010 180P strain) was established. The detection method is simple, and the whole operation process does not take 3 hours, and the time needed for the identification and detection of the virus wild virus and vaccine strains is significantly shortened, and the accuracy is high, Good specificity, good repeatability, accurate, rapid and high-throughput analysis are beneficial to the popularization and application in clinical practice.

【技术实现步骤摘要】
一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合
本专利技术涉及鉴别鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株
，尤其是用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合、试剂盒以及方法。
技术介绍
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Ducktembusuvirus，DTMUV)引起的一种新的鸭传染病，感染率达100％，发病率和死亡率为5％～30％，主要表现为生长缓慢、高热、食欲下降、产蛋量急剧下降甚至停止、病鸭死亡等临床症状，对我国养鸭业造成了严重的经济损失。DTMUV为有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类恩塔亚病毒群。DTMUV不仅可以感染鸭，还可以感染鸡、鹅、麻雀等禽类，甚至从蚊子中分离到病毒，在人血清和口腔拭子中也检测到DTMUV抗体和病毒核酸。由于目前尚无有效的治疗方案，接种疫苗仍然是预防该疾病流行的最有效方式。已经获批的鸭坦布苏病毒疫苗包括灭活疫苗HB株及活疫苗WF100株，另外还有2014年11月临床试验申请获批的FX2010-180P株等。由于活疫苗在临床使用存在一定的毒力返强及排毒风险，故接种活疫苗对疾病的及时准确诊断带来了一定的难度，从而影响其疾病治疗效果。有必要建立针对鸭坦布苏病毒疫苗株与野毒株的鉴别检测方法。目前对DTMUV的检测主要有病毒分离鉴定、套式RT-PCR、RT-LAMP、荧光定量RT-PCR、双抗体夹心ELISA，未检索到DTMUV野毒株与疫苗株的鉴别检测方法。因此，建立一种疫苗株与野毒株的鉴别检测方法具有重要意义。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，本专利技术提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，本专利技术还提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案：一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，所述引物的核苷酸序列如下所示：引物F：5'-ATAACAGTCAACCCATACGTGTC-3'；引物R：5'-CACTTCTATGCCACTGGTACCT-3'；所述探针的核苷酸序列：5'-CCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCG-3'，其中，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的至少一种，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中的至少一种。本专利技术提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物和探针的组合。优选地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品包括DTMUV野毒株的核酸、DTMUV活疫苗WF100株的核酸及FX2010-180P株的核酸。本专利技术提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，包括以下步骤：(1)从样品中提取病毒RNA；(2)以步骤(1)提取的病毒RNA为模板，以DTMUV野毒株的核酸、DTMUV活疫苗WF100株的核酸及DTMUV活疫苗FX2010-180P株的核酸作为阳性对照，采用上述所述的引物和探针的组合进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；(3)对扩增产物进行熔解曲线分析，将样品的熔解温度与阳性对照品的熔解温度进行比较，若样品的熔解温度与阳性对照的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有该阳性对照所对应的病毒株。熔解曲线分析技术是一种基于PCR结合靶序列与探针杂交后熔点发生变化而对基因SNP位点进行快速检测的方法，该法具有操作省时、高通量、避免污染、结果分析直观、易于判断、应用范围较广等优点。优选地，所述步骤(2)中的荧光PCR扩增反应体系为：优选地，所述步骤(2)中的荧光PCR扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。优选地，所述步骤(3)中的熔解曲线分析程序为：95℃变性10sec；37℃退火60sec；37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针荧光信号，进行熔解曲线分析。优选地，所述步骤(3)中将样品的熔解温度与阳性对照品的熔解温度进行比较的具体过程：若样品熔解温度与DTMUV活疫苗WF100株的核酸的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有鸭坦布苏病毒疫苗WF100株；若样品熔解温度与DTMUV活疫苗FX2010-180P株的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有鸭坦布苏病毒疫苗FX2010-180P株；若样品熔解温度与DTMUV野毒株的核酸的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于1.0℃，则判定样品中含有鸭坦布苏病毒野毒株。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术首次建立了一种可快速区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株的荧光PCR检测方法以及相应的引物和探针，该检测方法操作简单，只需一个反应即可实现鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株(WF100株和FX2010-180P株)的鉴别检测；检测速度快且高通量，全部操作过程不需3小时，显著缩短了病毒野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。(2)本专利技术的荧光PCR引物对F/R，对鸭坦布苏病毒可特异性扩增，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；本专利技术的探针可特异性与鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株(WF100株和FX2010-180P株)的鉴别位点杂交，特异性较好；引物对F/R和探针，均不与其他常见鸭源病毒核酸结合，有利于提高本专利技术对结果分析的正确性。(3)本专利技术的用于区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株的荧光PCR检测方法的最低检测限可达到每个反应单拷贝，灵敏度较高。附图说明图1为DTMUV标准化样品的熔解曲线图；图2为DTMUV荧光检测方法特异性试验熔解曲线图；图3为DTMUV核酸的灵敏度试验熔解曲线图；图4为DTMUV临床样品的熔解曲线图。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1引物及探针本申请的专利技术人对所设计的大量引物和探针进行试验筛选后，发现引物F/R，及探针P对熔解曲线分析法区分DTMUV野毒株与疫苗株的效果最好，其碱基序列如下所示。引物F：5'-ATAACAGTCAACCCATACGTGTC-3'(SEQIDNO：1)；引物R：5'-CACTTCTATGCCACTGGTACCT-3'(SEQIDNO：2)；探针P：5'-CCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCG-3'(SEQIDNO：3)，其中，所述探针P的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。实施例2标准样品的制备、荧光PCR扩增及熔解曲线分析1)鸭坦布苏病毒RNA的提取分别取DTMUV活疫苗WF100株及FX2010-180P株，加入3mLPBS盐酸缓冲溶液进行溶解，分别取DTMUV野毒株W株细胞培养液各200μL按TAKARA公司的MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下所示：引物F：5'‑ATAACAGTCAACCCATACGTGTC‑3'；引物R：5'‑CACTTCTATGCCACTGGTACCT‑3'；所述探针的核苷酸序列：5'‑CCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCG‑3'，其中，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下所示：引物F：5'-ATAACAGTCAACCCATACGTGTC-3'；引物R：5'-CACTTCTATGCCACTGGTACCT-3'；所述探针的核苷酸序列：5'-CCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCG-3'，其中，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物和探针的组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的至少一种，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中的至少一种。3.一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1或2所述的引物和探针的组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品，所述阳性标准品包括DTMUV野毒株的核酸、DTMUV活疫苗WF100株的核酸及FX2010-180P株的核酸。5.一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从样品中提取病毒RNA；(2)以步骤(1)提取的病毒RNA为模板，以DTMUV野毒株的核酸、DTMUV活疫苗WF100株的核酸及DTMUV活疫苗FX2010-180P株的核酸作为阳性对照，采用如权利要求1或2所述的引物和探针的组合或者如权利要求3或4所述的试剂盒进行荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志成，孙敏华，张春红，董嘉文，李林林，沈海燕，孙俊颖，张建峰，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44