一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒技术

本发明专利技术涉及兽医生物技术领域的快速诊断技术，具体是一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒。该发明专利技术设计了1套特异性引物和探针，结合高效的直扩RT‑PCR商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的直扩法荧光RT‑PCR检测试剂盒。该试剂盒能对检组织样品进行直接检测，检测过程简单，交叉污染几率小。从病料处理到获得结果只需1.5小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前猪流行性腹泻病毒检测方法非常好的一种替代方法。

Diagnostic method and special kit for detection of porcine epidemic diarrhea virus by direct expansion method

The invention relates to a rapid diagnostic technique in the field of veterinary biological technology, in particular a diagnostic method and a special kit for detecting porcine epidemic diarrhea virus by using direct expansion method. The invention has designed 1 sets of specific primers and probes, combined with high efficient direct expansion RT PCR commodity reagents, and optimized by experimental conditions, and combined a mature direct expansion method of fluorescence RT PCR detection kit. The kit can directly detect tissue samples. The detection process is simple and the probability of cross contamination is small. It is only 1.5 hours to get the result from the disease, and the result is accurate, high sensitivity and good specificity. It is a very good alternative to the current detection method of porcine epidemic diarrhea virus.

【技术实现步骤摘要】
一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒
本专利技术涉及兽医生物
的快速诊断技术，具体是一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)是可引发猪的一种高度接触性的肠道传染病（Pensaertetal.,1978），又名猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)。主要临床表现为病猪呕吐、急性水样腹泻、脱水以及仔猪的高死亡率等。本病可感染各个年龄阶段的猪，对不同年龄阶段的病猪的危害程度各不相同，尤其3日龄以内的仔猪发病情况最为严重，死亡率为80％-100％。近年来PED的蔓延趋势不断扩大，2013年在美国迅速发病并全美范围内传播流行，该病已在世界范围内造成严重的影响。20世纪八十年代猪流行性腹泻就在中国开始出现，在以后的时间里一直存在。剖检发病仔猪肠壁上有点状出血，肠壁变薄严重时呈透明状。可据此对腹泻症状进行初步疾病诊断，而确诊需要通过实验室检测技术。随着分子生物学技术的迅速发展，针对于PEDV核酸的检测方法越来越受到人们的青睐，RT-PCR方法对诊断PED具有很好的敏感性和特异性。Ishikawa等根据S基因序列设计了一对引物，扩增目的片段为854bp，建立的RT-PCR方法对细胞毒和粪便毒进行检测(Ishikawaetal.,1997)。郭容利建立了同时检测PEDV、TGEV和PARV多重RT-PCR方法，该法具有良好的特异性和敏感性(郭容利等，2013)。任玉鹏等建立了PEDV、PEV-9、PKV的三重RT-PCR，该方法与单项RT-PCR法相比，阳性样本的检出符合率在91%以上，表明该方法具有较高可信度，可以快速、准确的检测3种猪腹泻病毒性病原(任玉鹏等，2014)。荧光定量聚合酶链反应技术是指将反应体系中加入荧光基团，利用荧光实时监测的方法，并最终通过标准曲线对未知模板的检测方法进行定量分析。聚合酶链反应定量技术克服了简单的污染、长时间的处理步骤、缺乏准确、定量的方法。劳秀杰根据GenBank中的N基因高度保守核苷酸序列，设计合成一对引物，建立了检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。孟凡伟等通过构建含有M基因片段的重组质粒，利用该重组质粒进行SYBRGreenIReal-timePCR，成功的建立了检测PEDV的荧光定量PCR的方法。研究结果表明建立的Real-timePCR方法具有良好的特异性强、灵敏性，重复性(孟凡伟等，2014)。Zhao等利用PEDVS基因，设计引物，建立了多重探针荧光定量PCR的技术方法，在区分变异毒株和经典毒株，该方法能得到很好的应用(Zhaoetal.,2014)。刘邓等成功建立了一种快速检测PEDV病毒含量的TaqMan焚光定量PCR方法，借用此方法对60份临床样品进行检测，55份阳性样品，检测阳性率为92%，而对同种样品用常规RT-PCR方法检出阳性率仅为80%，表明该荧光定量PCR方法的具有良好的敏感性（刘邓等，2010）。直扩荧光RT-PCR方法是利用一类经过基因工程改造的高耐受的TaqDNA聚合酶，这类酶可以直接以全血、血清、尿液、粪便、土壤、牛奶、动物组织等材料为模板，无需经过核酸提取的步骤，经一步RT-PCR扩增目的基因，从而显著简化检测流程，节省时间和成本，提高检测效率。目前国内外已经建立了多种检测PEDV核酸的RT-PCR或荧光RT-PCR方法，但还未见关于PEDV直扩荧光RT-PCR方法的报道。本专利技术以PEDV的N基因为靶序列，分别设计特异性的引物和探针，通过反应条件的优化，建立了一种检测猪流行性腹泻病毒的直扩荧光RT-PCR方法，并组装成了试剂盒进行应用。
技术实现思路
本专利技术根据GenBank中登录猪流行性腹泻病毒（PEDV）的N基因序列，应用DNASTAR、MegAlign软件的序列比对功能及PrimerExpress3.0软件，设计了1套特异性引物和探针，结合高效的直扩RT-PCR商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的直扩法荧光RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒能对检组织样品进行直接检测，检测过程简单，交叉污染几率小。从病料处理到获得结果只需1.5小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前猪流行性腹泻病毒检测方法非常好的一种替代方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样来实现的：一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，包括以下引物序列，其核苷酸序列为：PEDV上游引物：5’-TGGCATTTCTACTACCTCGG-3’；PEDV下游引物：5’-AGTGGGTTCAGTCTTTGCG-3’；PEDV探针引物：5’-HEX-ACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGT-BHQ1-3’。上述应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，该试剂盒反应体系中包含以下成分：2×S/PqRT-PCRmix；25×S/PqRTPCRPolymerases；10µMPEDV上游引物；10µMPEDV下游引物；10µMPEDV探针引物；阳性对照；阴性对照。其中将PEDV分离株接种到含有5µg/mL胰酶培养液的Vero细胞单层，至72h时后，细胞出现聚集、融合形成合胞体等细胞病变，细胞病变率达75%左右时，冻融收集细胞毒，8000r/m离心5min，收集上清为阳性对照；高压灭菌处理DEPC水为阴性对照。一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，使用上述引物的试剂盒，包括以下步骤：取疑似感染PEDV的病料，稀释、离心后取上清液为检测样品，用上述引物进行荧光RT-PCR扩增，反应结束后，根据扩增曲线和CT值判定结果，反应结果在HEX通道检测。进一步的，应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，该试剂盒反应体系为25µL时，反应体系中包含以下成分：2×S/PqRT-PCRmix12.5µL、25×S/PqRT-PCRPolymerases1µL，上、下游引物（10µM）各1µL，探针引物（10µM）0.5µL，检测样本5µL，DEPC水4.0µL。荧光RT-PCR循环条件为：50℃30min，95℃5min，然后94℃10s，60℃30s，进行40个循环。具体的应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，包括以下步骤：（1）检测样本制备取疑似感染PEDV的小肠内容物或粪便作为检测病料，用PBS稀释成1：3乳剂，8000r/min离心5分钟，上清为检测样本；（2）直扩荧光RT-PCR反应体系建立和扩增取荧光定量PCR反应管，加入2×S/PqRT-PCRmix12.5µL、25×S/PqRT-PCRPolymerases1µL，PEDV上、下游引物（10µM）各1µL，PEDV探针引物0.5µL（10µM），检测样本5µL，DEPC水4.0µL，进行荧光RT-PCR扩增；荧光RT-PCR循环条件为：50℃30min，95℃5min，然后94℃10s，60℃30s，进行40个循环；（3）直扩荧光RT-PCR检测结果判定反应结束后，根据扩增曲线和CT值判定结果，反应结果在HEX通道检测，扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的检测样品直接判定为阳性，扩增反应在35个循环以上的需要重复试验，若本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，其特征在于：包括以下引物序列，其核苷酸序列为：PEDV上游引物：5’‑TGGCATTTCTACTACCTCGG‑3’；PEDV下游引物：5’‑AGTGGGTTCAGTCTTTGCG‑3’；PEDV探针引物：5’‑HEX‑ACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGT‑BHQ1‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，其特征在于：包括以下引物序列，其核苷酸序列为：PEDV上游引物：5’-TGGCATTTCTACTACCTCGG-3’；PEDV下游引物：5’-AGTGGGTTCAGTCTTTGCG-3’；PEDV探针引物：5’-HEX-ACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGT-BHQ1-3’。2.根据权利要求1所述的应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，其特征在于：该试剂盒反应体系中包含以下成分：2×S/PqRT-PCRmix；25×S/PqRT-PCRPolymerases；10µMPEDV上游引物；10µMPEDV下游引物；10µMPEDV探针引物；阳性对照；阴性对照。3.根据权利要求2所述的应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，其特征在于：将PEDV分离株接种到含有5µg/mL胰酶培养液的Vero细胞单层，至72h时后，细胞出现聚集、融合形成合胞体等细胞病变，细胞病变率达75%左右时，冻融收集细胞毒，8000r/m离心5min，收集上清为阳性对照；高压灭菌处理DEPC水为阴性对照。4.一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的试剂盒，包括以下步骤：取疑似感染PEDV的病料，稀释、离心后取上清液为检测样品，用引物进行荧光RT-PCR扩增，反应结束后，根据扩增曲线和CT值判定结果，反应结果在HEX通道检测。5.根据权利要求4所述的应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，其特征在于：该试剂盒反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金良，邓凤林，李滨，钟立伟，方俊建，何木春，徐浩勇，胡绍良，
申请(专利权)人：深圳市康百得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44