一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法。本发明专利技术RPA荧光定量引物对是针对HPV18病毒的基因组中的L1区域设计筛选获得的，本发明专利技术方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测HPV18，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。RPA荧光定量扩增后，再用测流层析试纸条结合便携式的干式荧光免疫分析仪进行结果检测分析，从而整个过程中涉及的仪器均为小体积便携式，不受实验仪器和场地限制，并且在很大程度上减少了传统的胶体金等显色法结果判定时人为因素的影响，灵敏度可以达到5拷贝。

RPA fluorescent quantitative primer pair, probe, kit and method for detecting HPV18

The invention discloses a RPA fluorescent quantitative primer pair, probe, reagent kit and method for detecting HPV18. The RPA fluorescent quantitative primer is obtained by designing and screening the L1 region in the genome of the HPV18 virus. The invention is a fluorescence quantitative detection method based on RPA technology, which can be used for specific detection of HPV18. The method is simple in operation, high in sensitivity, mild reaction conditions, short reaction time, and combined with portable fluoro. The rapid quantitative detection of pathogenic microorganism can be carried out by optical detector. After the quantitative amplification of RPA fluorescence, the results were detected and analyzed with a flow test paper strip combined with a portable dry fluorescent immunoanalyzer. All the instruments involved in the whole process were small and portable, not limited by the experimental instruments and site, and to a large extent reduced the results of the traditional colloidal gold and other color rendering methods. The sensitivity of human factors can reach 5 copies.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
人类乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。流行病学和分子学研究证实了HPV感染是宫颈癌的病因。生殖道HPV感染是一种常见的性传播疾病。由于女性宫颈癌发生的主要原因是长期反复的高危型HPV感染，故HPVDNA的快速检测为预防和治疗宫颈癌的最有效手段之一。核酸扩增PCR技术由于其灵敏度高和特异性强等方面的优势，已经成为科学研究和临床研究中的一个基础和必要的技术手段。然而，PCR技术通常需要特制的仪器以及复杂的反应程序，成本高，耗时长，对于需要实时、现场、快速的非实验室环境检测及分析通常难以实现。近年来，基于模拟体内核酸复制、转录、修复机理发展起来的核酸体外等温扩增(Nucleicacidisothermalamplification，NCIA)技术的出现，解决了PCR技术上的局限，不仅简化了对仪器的要求，不需要昂贵的PCR仪，还缩短了反应时间，恒温条件下即可快速扩增出目标核酸片段。因其反应快速、灵敏度高、操作简便等优点而受到了多个领域的关注，尤其是体外诊断领域。目前，报道的NCIA技术有loop介导的体外恒温扩增(Loop-mediateisothermalamplification，LAMP)，核酸序列依赖扩增(Nucleicacidsequencebasedamplification，NASBA)，链置换扩增(Stranddisplacementamplification，SDA)，滚环扩增技术(rollingcircleamplification，RCA)。但这些恒温扩增技术在反应条件、反应试剂、反应时间、仪器设备以及操作简便性等方面存在较大的弊端。如LAMP对引物要求高，设计复杂，且产物结构复杂。NASBA通常扩增时间较长(约2-3小时)，需要抽提RNA，且当模板是DNA时需要高温变性处理。SDA需要反应前对模板进行热变性处理，才能引发带有核酸内切位点引物的配对。RCA需要设计一段锁式探针，通常在100bp左右，合成费用较高，并且在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA可能产生一些背景信号。重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)能够在恒温条件下(37℃-42℃)实现对核酸的快速特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，能够在非实验室条件下完成核酸检测，被称为是最具有可替代PCR潜力的核酸检测技术，且可以和琼脂糖凝胶检测、荧光检测技术结合实现实时、快速甚至定量检测。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法。一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对，包括上游引物和下游引物，序列为上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’，其中，下游引物的5’端连接或者不连接生物素。RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，普通PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。生物素主要是用于最后扩增产物的捕获，以便进行信号的检测，根据需要确定是否需要连接。一种用于检测HPV18的RPA荧光定量探针，序列为：5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGG-3’，其中，探针的其中一个核苷酸上连接有荧光基团，且位于该核苷酸靠近3’端一侧的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，可以提高RPA检测的特异性，当上、下游引物扩增出片段后，探针可以结合上去，然后探针在脱碱基位点被切开，5’端的序列可以作为巢式PCR引物，与下游引物作为一对扩增引物继续对模板进行扩增，使正确扩增的模板数量增加，而上、下游引物非特异性扩增出的片段由于探针无法结合，不能被巢式PCR扩增，从而通过加入探针可以降低非特异性扩增，同时起信号放大作用。而荧光基团用于最后的信号检测，通过检测荧光信号判断样本中是否存在目标基因片段，从而判断是否存在HPV18。脱碱基位点为一个缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，该位点能被一些核酸内切酶或者核酸外切酶识别，从而对序列进行切割，使探针位于脱碱基位点靠近5’端的序列剩下作为巢式PCR引物。荧光基团连接的位置比较随意，只需要连接在脱碱基位点的靠近5’一侧即可，而脱碱基位点在被切割断开后，作为巢式PCR引物的5’一侧需要保留作为巢式PCR引物的足够长度。优选的，所述的RPA荧光定量探针，序列为：5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAAHAGCAGTATTTTAGAGG-3’，其中，探针的5’端连接荧光基团，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，为脱碱基位点，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。优选的，所述荧光基团为CY5、CY3、FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA；所述修饰基团为磷酸基。本专利技术对荧光基团的选择并没有特殊性，常用的用于荧光定量PCR的荧光基团均可使用。普通引物序列3’没有磷酸基团而是-OH，只有3’末端是-OH的片段才可以被聚合酶延伸，但3’修饰了磷酸基后，所得探针只能结合到模板上而不能扩增。本专利技术还提供了一种用于检测HPV18的RPA荧光定量试剂盒，包含所述的RPA荧光定量引物对和所述的RPA荧光定量探针。优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括核酸内切酶EndoⅣ。核酸内切酶EndoⅣ识别dsDNA中的脱嘌呤/嘧啶(AP)位点，切割损伤位点5’端的磷酸二酯键，产生具有羟基基团的3’-末端。优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括试剂盒nfoKit中的所有试剂。本专利技术还提供了一种检测HPV18的方法，使用所述的RPA荧光定量试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)提取样本DNA作为模板；(2)使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步骤(1)所得模板进行RPA荧光定量扩增；(3)通过检测荧光定量信号对样本中HPV18的含量进行检测。优选的，所述的方法，步骤(3)中使用测流层析试纸条进行检测，当下游引物的5’端连接生物素时，所述测流层析试纸条上的检测线包含链霉亲和素或抗生物素抗体或抗所述荧光基团的抗体；当下游引物的5’端不连接生物素时，所述测流层析试纸条上的检测线包含抗所述荧光基团的抗体，检测荧光定量信号的方法包括：(a)取RPA荧光定量扩增产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为上游引物：5’‑ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC‑3’；下游引物：5’‑ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT‑3’，其中，下游引物的5’端连接或者不连接生物素。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’，其中，下游引物的5’端连接或者不连接生物素。2.一种用于检测HPV18的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGG-3’，其中，探针的其中一个核苷酸上连接有荧光基团，且位于该核苷酸靠近3’端一侧的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。3.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAAHAGCAGTATTTTAGAGG-3’，其中，探针的5’端连接荧光基团，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，为脱碱基位点，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。4.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，所述荧光基团为CY5、CY3、FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA；所述修饰基团为磷酸基。5.一种用于检测HPV18的RPA荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大龙，罗春华，戴群莹，胡小伟，韩斌，华绍炳，
申请(专利权)人：杭州德同生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33