一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。该引物是根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。通过本发明专利技术试剂盒检测，所得结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以应用于树鼩腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

A real-time fluorescent quantitative PCR primer, probe and kit for detection of tree shrew adenovirus

The invention relates to a real-time fluorescent quantitative PCR primer, probe and reagent kit for detecting tree shrew adenovirus, and belongs to the field of biotechnology. The primers were designed and synthesized according to the 3 'terminal conservative sequence of the whole genome of tree shrews isolated and sequenced in our laboratory. There was no cross reaction with common viruses in tree shrews and other species. The 5' end of the probe was linked to a fluorescent report group and the 3 'terminal was linked to a fluorescence quenching group. Through the detection of the kit, the results are more accurate, reliable, stable and repeatable. It has high sensitivity, high accuracy, wide range of detection. It can also be applied to epidemiological investigation caused by adenovirus in tree shed, and can also provide technical support for related basic research, and has wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒，更具体涉及一种检测树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物和探针，同时还涉及树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，该TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对各种生物材料的树鼩源腺病毒进行定量检测和质量监控，也可以进行树鼩腺病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
技术介绍
树鼩腺病毒(TreeShrewAdenovirus，TAV)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。腺病毒无囊膜，病毒粒子为二十面体，直径为80～110nm，由252个壳粒组成。一般感染哺乳动物的腺病毒相对分子质量为20～25×106，G+C含量为48%～61%。迄今，已发现有100多种腺病毒能感染人、哺乳动物和禽类。腺病毒分布十分广泛，一般对于人体没有致癌性，但是腺病毒感染会引起急性上呼吸道感染、急性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等疾病。前期开展的相关研究表明，野生来源树鼩中腺病毒携带率较高，并有疑似病例发生，被列为树鼩实验动物微生物质量控制的检测指标之一。因此，建立一种高效、快速，可反应个体病毒载量的实时荧光定量PCR方法势在必行。目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：a）血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。b)生物学试验包括动物实验和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。c)分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测树鼩腺病毒持续感染。相比之下，PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。但普通的PCR检测方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始的DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-timefluorescencequantitativePCR)有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。目前使用比较多的是SYBRGreenI荧光染料法和Taqman法。两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针及方法和试剂盒，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短，同时，本专利技术试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物，核苷酸序列为：上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′，下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′。本专利技术还提供与所述引物配合使用的探针，核苷酸序列为：5′-Fam–CTCGCCGCCGCCGGTTTCAC-Tamra-3′。本专利技术同时提供含有上述引物和/或探针的试剂盒。进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括：还包括：标准阳性模板、阴性对照模板和实时荧光定量PCR反应液；所述的标准阳性模板是含有阳性TAV特异性保守序列的PUC57载体质粒；所述的阴性对照模板为从树鼩分离出的不同于树鼩腺病毒的其它病毒。进一步，优选的是，所述的阴性对照模板为树鼩呼肠孤病毒。进一步，优选的是，还包括空白对照模板，所述的空白对照模板为灭菌的双蒸水。进一步，优选的是，所述的实时荧光定量PCR反应液包括2×iTaqTMUniversalProbesOne-StepReactionMix和EasyDilution进一步，优选的是，其工作反应体系为：模板3μL，上游引物10μM1μL，下游引物10μM1μL，探针10μM2μL，2×iTaqTMUniversalProbesOne-StepReactionMix10μL，EasyDilution3μL，总计20μL。进一步，优选的是，其工作程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，58℃退火30s，共40个循环。进一步，优选的是，标准阳性模板的质粒拷贝数为1×107copies/μL。本专利技术中所述引物是根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。使用该引物进行PCR扩增，可实现特异性好、灵敏度高、准确型强的定性、定量检测。通过本专利技术试剂盒检测，所得结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以应用于树鼩腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。本专利技术中所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：AAAGAATGCCCACCTCCCATGTGGTGCTACACTTACTTGCTGCGCCTAGCCAACTACTTTATGTACCACAACGACCTGGCTAGTGAAACCGGCGGCGGCGAGGGCTTAATGGCCTGCCACTG。（SEQIDNO.4）本专利技术所采用的是基于TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其荧光信号只来源于目标序列，即不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。除此之外，还可以利用不同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的目的，并且其特异性更强、准确性更高。在样本量比较大的情况下，成本甚至可以低于染料法。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：1.简单快速：生物学试验包括动物实验和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性、高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实施扩增曲线，准确的确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的核酸定量。2.灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测树鼩的潜在感染，其中血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。利用本专利技术中的实时荧光定量PCR检测树鼩腺病毒时，可以准确定量，目标DNA在101~108浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达到3.7copies/μL。3.重复性、准确性和特异性：本专利技术中的引物和探针根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，检测特异性强，重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，核苷酸序列为：上游引物：5′‑AAAGAATGCCCACCTCCCAT‑3′，下游引物：5′‑CAGTGGCAGGCCATTAAGC‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，核苷酸序列为：上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′，下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′。2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，核苷酸序列为：5′-Fam–CTCGCCGCCGCCGGTTTCAC-Tamra-3′。3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的试剂盒。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：标准阳性模板、阴性对照模板和实时荧光定量PCR反应液；所述的标准阳性模板是含有阳性TAV特异性保守序列的PUC57载体质粒；所述的阴性对照模板为从树鼩分离出的不同于树鼩腺病毒的其它病毒。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照模板为树鼩呼肠孤病毒。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓梅，宋庆凯，李晓飞，代解杰，罕园园，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53