RAA荧光法检测狂犬病病毒的探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种检测狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，检测试剂盒包括以下组分：RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、探针与引物混合物、阴性质控品、阳性质控品及临界阳性质控品。所述探针为5’端序列(荧光报告基团)(THF)(淬灭基团)3’端序列；本试剂盒可直接对狂犬病病毒DNA检测，尤其可用于检测狂犬病病毒DNA含量较低的样品；本试剂盒在30～42℃下进行等温扩增检测，5～20min完成检测。试剂盒操作简单，配合小型仪器、携带方便，具有快速、灵敏、准确、重复性好的优点；适合基层和现场检测，具的良好的应用前景。

Probes and kit for detection of rabies virus by RAA fluorescence method

The present invention discloses a detection kit for detection of rabies virus RAA fluorescence method. The detection kit includes the following components: RAA basic fluorescence general reaction reagent, reaction buffer solution, probe and primer mixture, negative quality control product, positive quality control product and critical positive quality control product. The probe is 5 'end sequence (THF) (fluorescence report group) (quenching group) 3' end sequence; this kit can be used to detect rabies virus DNA directly, especially for detection of low DNA content of rabies virus; this kit is detected by isothermal amplification at 30~42 C and 5 ~ 20min. The kit is easy to operate with small instrument and convenient to carry. It has the advantages of fast, sensitive, accurate and reproducible. It is suitable for the base and field detection and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
RAA荧光法检测狂犬病病毒的探针及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测狂犬病病毒RAA荧光法检测的探针、引物和试剂盒。
技术介绍
狂犬病是世界上最可怕的人兽共患传染病之一。其病原狂犬病毒(RabiesVirus)，属于弹状病毒(Rhabdovidae)、狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病毒主要通过破损的皮肤或粘膜进入人体，经神经末梢上行进入中枢神经系统。临床表现主要为急性、进行性、几乎不可逆转的脑脊髓炎。人一旦发病，100％死亡。狂犬病已成为我国最高的传染病病种。野生动物是狂犬病的主要储存宿主，犬猫、家畜是人狂犬病的主要传染来源。据统计全球每年狂犬病死亡人数超过6万，其中绝大部分病例出现在亚洲和非洲，而亚洲每年狂犬病病例约占全球病例总数的56％。近年来随着猫、犬等宠物的增加，该病发病率逐年上升[13]。中国卫生部发布全国法定传染病疫情报告称,我国这几年来狂犬病人数程上升趋势，是仅次于印度，是受狂犬病危害较严重的国家之一。因此，狂犬病的防控已成为紧迫的任务。对狂犬病病毒的检测，目前的方法有：荧光抗体试验(FAT)、快速狂犬病酶免疫诊断法(ELISA)小鼠颅内接种分离狂犬病毒法(MIT)、细胞培养分离技术(CIT)、RT-PCR等。其中FAT是检测狂犬病病毒的“金标准”，但需要昂贵的荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体，且荧光阳性和阴性不易辨认，必需要有经验的操作人员。MIT需要1周以上的时间才能完成实验，且需用FAT才能判定结果。CIT需要在有细胞培养条件的实验室进行，也需要配合FAT才能判定结果。ELISA方法简单、快速，但重复性差，灵敏度不够，对于动物咽拭子等病毒含量较少的样品，检出率低。RT-PCR目前广泛应用于狂犬病病毒核酸的检测。与传统的病毒分离或免疫学检测法相比，RT-PCR具有高特异性、高灵敏度的特点，因此更广泛地用于狂犬病的常规检测及分子流行病学研究。RT-PCR还适用于FAT不能检测的已经腐败的样品和液态的样品，如唾液和脑脊液。对可疑活体动物样品的检验，特别是动物感染早期唾液毛发等样品的检验上，RT-PCR与传统方法相比有无可比拟的优势。然而，此方法不仅需要相关的昂贵仪器设备且需要有专业技术人员操作，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制；整体实验时间在2－4小时，且PCR操作繁琐，容易发生交叉污染。
技术实现思路
为了解决现有技术检测方法中费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器，假阳性率高等问题，本专利技术公开了一种RT-RAA(ReverseTranscription-RecombinaseAidedAmplification)法检测狂犬病病毒的引物探针及试剂盒。具有特异性强、灵敏度高、快速方便的特点，具有较大的应用价值。本专利技术实施例提供了一种用于检测狂犬病病毒核酸的引物、荧光探针和试剂盒。本专利技术的试剂盒及检测方法采用RAA技术，克服了以上的缺点，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点。具体的，本专利技术所述的技术方案如下：首先，本专利技术公开一种RAA荧光法检测狂犬病病毒的探针，所述探针为：5’端序列(荧光报告基团)(THF)(淬灭基团)3’端序列；其中：所述5’端序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其序列信息为CTTTGAAGCCTGAGATTATCGTGGATCAA；所述3’端序列的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，其序列信息为GAGTACAAGTACCCTG。因此，整个探针序列也可以表示为：5’-SEQIDNO.3(荧光报告基团)(THF)(淬灭基团)SEQIDNO.4-3’。其中，所述THF为四氢呋喃残基；所述荧光报告基团可以选择：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种，所述淬灭基团可以选择：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。5’-CTTTGAAGCCTGAGATTATCGTGGATCAATATGAGTACAAGTACCCTG-3’5’-CTTTGAAGCCTGAGATTATCGTGGATCAA(FAM-dT)(THF)(BHQ-dT)GAGTACAAGTACCCTG-3’是在本专利技术的实施例中具体使用的探针，其设计的特征在于：所述探针采用修饰基团进行修饰；所述修饰基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基位置，四氢呋喃残基替换第31位碱基A。本专利技术提供的引物适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出狂犬病病毒，特异性达100％。本专利技术的另一方面，在于公开一种狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，其包括上文所述的探针以及下述引物：上游引物：5’-CAATGGATGCCGACAAGATTGTRTTCAAAGT-3’(SEQIDNo.1)；下游引物：5’-CTGCYAARTAGGAACATACRTCATCAGGATCT-3’(SEQIDNo.2)。对于上文技术方案所述的一种狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，本专利技术对探针和引物在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述的探针使用时在反应体系中的终浓度为0.02-0.05mM，所述上游引物及下游引物使用时在反应体系中的终浓度为0.05-0.1mM。对于上文技术方案所述的一种狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，所述试剂盒还包括试剂RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。其中：所述的RAA基础荧光通用反应试剂是经过低温冷冻干燥的冻干粉，由江苏奇天基因生物科技有限公司提供；是商品货号为F00001的基础反应单元。本领域技术人员，也可以根据RAA荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为RAA基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。对于上文技术方案所述的一种狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，所述的反应缓冲液由以下试剂组成：在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述反应缓冲液中各组分的使用浓度为500mmol/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为250mmol/L的MgAc和质量分数为10％的PEG20000。优选的，所述反应缓冲液PH7.6。对于上文技术方案所述的一种狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，所述试剂盒还包括如下试剂：阴性质控品、阳性质控品和/或临界阳性质控品；所述阳性质控品含为狂犬病病毒的基因组DNA片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，阳性质控品的使用浓度为1.0×105IU/mL；也可以选择高于此浓度的任意一个浓度作为阳性质控品。所述临界阳性质控品为含狂犬病病毒的基因组DNA片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，临界阳性质控品的使用浓度为1.0×102IU/mL；所述阴性质控品为不含有狂犬病病毒的基因组片段的试剂，一般选择ddH2O或纯化水。所述试剂盒方便准确地鉴定狂犬病病毒的存在，操作简便，检测时间短，仅需5～20min即可完成，无需通过高温使DNA解旋，只需在3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.RAA荧光法检测狂犬病病毒的探针，其特征在于，所述探针为5’端序列(荧光报告基团)(THF)(淬灭基团)3’端序列；其中：所述5’端序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述3’端序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述THF为四氢呋喃残基；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。

【技术特征摘要】
1.RAA荧光法检测狂犬病病毒的探针，其特征在于，所述探针为5’端序列(荧光报告基团)(THF)(淬灭基团)3’端序列；其中：所述5’端序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述3’端序列的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述THF为四氢呋喃残基；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。2.一种狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的探针以及下述引物：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的狂犬病病毒RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述的探针终浓度为0.02-0.05mM，所述上游引物及下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴斌，苏立明，梁华，李忠起，梁健健，郭利川，王智宏，应清界，
申请(专利权)人：吴斌，江苏奇天基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21