本发明专利技术提供了一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，包括FAdV‑4‑F和FAdV‑4‑R。所述引物对可用于制备安卡拉病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对安卡拉病毒进行病毒含量的检测。该试剂盒包括阳性对照标准品、PCR反应液和阴性对照；所述阳性对照标准品为含有FAdV‑4序列的重组质粒pMD18‑FAdV‑4；所述PCR反应液包括提取的模板DNA，引物对，SYBR GreenⅠ荧光染料溶液，Taq酶，ddH2O，所述SYBR GreenⅠ荧光染料溶液包括SYBR Green I荧光染料、dNTP、反应缓冲液；双蒸水作为阴性对照。用本发明专利技术的引物对制备的安卡拉病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对安卡拉病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。
Real time fluorescent quantitative PCR primers and kit for Ankara virus
The invention provides a real-time fluorescent quantitative PCR primer pair for Ankara virus, including FAdV 4 F and FAdV 4 R. The primer pair can be used for preparing real-time fluorescence quantitative PCR detection kit for Ankara virus, so as to detect virus content of Ankara virus. The kit includes positive control standard, PCR reaction liquid and negative control; the positive control standard is the recombinant plasmid pMD18 FAdV FAdV 4, which contains the sequence of 4, including the extracted template DNA, the primer pair, the SYBR Green I fluorescent dye solution, the Taq enzyme, ddH2O, and the SYBR Green I fluorescent dye. The solution consisted of SYBR Green I fluorescent dye, dNTP, reaction buffer and double distilled water as negative control. The detection method of real time fluorescence quantitative PCR detection kit for Ankara virus, which is prepared by the primers of the invention, is simple, quick, reproducible, highly sensitive and specific, and can be used to detect large flux samples, and can be used for rapid and high sensitivity real-time fluorescence quantitative PCR detection for Ankara virus.
【技术实现步骤摘要】
安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对及试剂盒
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对及试剂盒。
技术介绍
安卡拉病是由禽腺病毒C种血清型4型(FAdV-4)引起的一种以心包积液，肝脏出血、肿大为特征的传染病。最早在1987年发现于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，因此称“安卡拉病”。根据其发病特征，也将其称为“鸡心包积液-肝炎综合征”。安卡拉病在2015年夏天首先在山东聊城地区的莘县引起肉鸡群大量发病，随后迅速传播至其他地方的肉食鸡、三黄鸡、麻鸡等。死亡率高达10％～80％。且该病的发病区域正在不断扩大，给养鸡业造成了一定的经济损失。目前，已建立的FAdV-4的现有检测方法还较为单一，主要还是利用传统聚合酶链式反应法(PCR)进行检测，快速、敏感等方面尚有不足。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种实时荧光定量PCR检测安卡拉病的引物对。本专利技术所采取的技术方案是：一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，包括FAdV-4-F：5′-CTTCGCAAGTCTCAGTA-3′(SEQID№1)和FAdV-4-R：5′-GTGCCCGTGTTATCCA-3′(SEQID№2)。所述引物对是根据GenBank上已发表的FAdV-4的Hexon全基因组序列[登录号：EU931692.1]的保守序列而设计。本专利技术的引物对可用于制备安卡拉病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对安卡拉病毒(FAdV-4)进行病毒含量的检测。该试剂盒包括阳性对照标准品、PCR反应液和阴性对照；所述阳性对照标准品为含有FAdV-4序列的重组质粒pMD18-FAdV-4；所述PCR反应液包括提取的模板DNA，如前所述的引物对，SYBRGreenⅠ荧光染料溶液，Taq酶，ddH2O，所述SYBRGreenⅠ荧光染料溶液包括SYBRGreenI荧光染料、dNTP、反应缓冲液；双蒸水作为阴性对照。用本专利技术的引物对制备的安卡拉病毒(FAdV-4)实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对安卡拉病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。附图说明图1是荧光定量PCR标准曲线；图2是荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线；图3是荧光定量PCR特异性试验图，其中标号1为阴性对照，2为FAdV-4阳性DNA，3为减蛋综合征病毒(EDSV)，4为新城疫病毒(NDV)，5为H5亚型禽流感病毒，6为H9亚型禽流感病毒的核酸，7为H9亚型禽流感病毒的cDNA；图4为10个稀释度标准样品的灵敏性试验扩增曲线图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1，荧光定量PCR方法的建立FAdV-4基因组目的片段PCR扩增：取收集的鸡胚尿囊液，于3000r/min,4℃离心10min后，收集上清液提取病毒核酸。PCR反应体系为：PrimixExTaqTM酶12.5μL，上、下游引物各1μL(10μmol/L)，DNA模板2μL，加灭菌三蒸水至总体积25μL。上述各组分混匀瞬时离心后，在温度梯度PCR仪上执行以下程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，47℃退火54.5s，72℃延伸60s；进行34个循环，最后72℃延伸10min。取5μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。FAdV-4阳性对照标准品的制备：目的PCR产物电泳后，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收，按照目的片段与pMD-18T载体分子比5∶1的比例进行连接、转化、菌落PCR鉴定、序列分析，并对阳性对照标准品进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。实时定量PCR反应及标准曲线和回归方程的建立：少量提取阳性对照标准品经纯化后，测定其在260nm和280nm处的吸光值，计算出质粒浓度和纯度依据推算分子量计算目的基因拷贝数，对阳性重组质粒进行10倍梯度稀释，作为实时定量PCR的标准品。反应条件和PCR体系如表1所示：表1反应条件和PCR体系实施例2，FAdV-4目的片段PCR扩增与重组质粒的鉴定将FAdV-4的Hexon保守序列中长度为114bp的目标片段纯化与pMD-18T载体连接后，将连接产物转化入DH5α感受态细胞，同时对转化成功的菌落进行纯化培养，并进行PCR及测序鉴定，与预期结果一致。序列测定结果表明，与DuCV基因组的对应区域的同源性为100％，将构建成功的含有目的基因重组质粒命名为pMD18-FAdV-4。实施例3，实时定量PCR反应及标准曲线的绘制将少量提取并纯化后的pMD18-FAdV-4质粒测得OD260nm和OD280nm分别为0.165和0.089，相应浓度的重组质粒拷贝数为2.40×108拷贝/μL，将重组质粒进行10倍梯度稀释，取100～106拷贝数的重组质粒建立标准曲线，横坐标代表质粒拷贝数的对数(X)，纵坐标为Ct值(Y)；在此基础上推导出相应的回归方程为y＝-3.1245x+34.197，回归方程与标准曲线的相关系数(R2)为0.997，扩增效率为1.090，结果如图1所示。荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线见图2。标准品各个稀释度的溶解温度Tm值在86.0～86.5℃之间，无引物二聚体和非特异性扩增产物出现，所建立PCR方法的引物特异性好。实施例4，特异性试验特异性、灵敏性及重复性试验：采用建立的荧光定量PCR方法对FAdV-4阳性DNA、减蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的核酸或cDNA进行扩增，同时设立阴性对照，结果如图3所示，其溶解曲线单一，表明该方法具有良好的特异性。实施例5，灵敏性试验将已计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释，作10次稀释，每个梯度浓度的重组质粒分别作为模板，在最佳反应条件下进行荧光定量PCR扩增，结果见图4。由图4可知，能检测出来的最低拷贝数为6.72×10-1拷贝/μL。实施例6，重复性试验以6.72×103、6.72×104、6.72×105拷贝/μL3个稀释度的FAdV-4重组质粒样品作为模板，以最佳反应条件进行荧光定量PCR的批内和批间重复性试验，结果见表2。由表2可知，3次批内和批间重复性试验的变异系数均小于2％。表明建立的荧光定量PCR的方法具有较好的重复性。表2荧光定量PCR的批内与批间重复性试验结果荧光定量PCR是在PCR反应过程中通过连续监测荧光信号的强弱来实时测定特异性产物的量，并据此推断检测病料的初始含毒量，不仅有常规PCR技术的扩增高效率的特点，还具有高度的特异性、光谱技术的高敏感性和精确性等特点，同时避免了后续电泳等步骤，减少了污染和人为操作带来的误差。采用该方法检测减蛋综合征病毒(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒的核酸或cDNA结果均为阴性，说明该方法具有良好的特异性；在重复性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括SEQ ID № 1所示的FAdV‑4‑F和SEQ ID № 2所示的FAdV‑4‑R。
【技术特征摘要】
1.一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括SEQID№1所示的FAdV-4-F和SEQID№2所示的FAdV-4-R。2.一种安卡拉病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括阳性对照标准品...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄雯晶，黄淑坚，李智丽，黄兴国，刘佑明，梅敏敏，李晓文，李文锋，傅禹铭，黄浩琪，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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