一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术构建了一株过表达SEQ ID NO.1所示柠檬酸合成酶的基因工程菌Mgly145，该基因工程菌在摇瓶发酵中乙醇酸产量为1.369g/L，产率为0.504g/g‑葡萄糖，较基因工程菌Mgly14的乙醇酸产率提高了30.9％。分批发酵中与Mgly14相比，Mgly145的乙醇酸产量提高了8.8％，产率提高了14.6％，而且乙酸积累量减少了67.5％。

A method to increase the yield of glycolic acid in Escherichia coli

The invention discloses a method for improving the yield of glycolic acid in Escherichia coli, and belongs to the field of biotechnology. This invention has constructed a gene engineering strain Mgly145 of citrate synthetase expressed in SEQ ID NO.1. The production of glycolic acid is 1.369g/L in the shake flask fermentation, the yield is 0.504g/g glucose, and the yield of glycolic acid is increased by 30.9% compared with the gene engineering bacteria Mgly14. Compared with Mgly14, the yield of glycolic acid in Mgly145 increased by 8.8%, yield increased by 14.6%, and acetic acid accumulation decreased by 67.5%.

【技术实现步骤摘要】
一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
本专利技术涉及一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，属于生物工程

技术介绍
乙醇酸(glycolicacid，glycolate)又称羟基乙酸、甘醇酸，是最简单的α-羟基酸。近年来，乙醇酸广泛用于纺织工业、医学工程材料、化学清洗等许多领域，需求量逐年增加。目前已经报道了很多利用全生物合成进行乙醇酸生产的方法，在微生物中利用乙醛酸循环——过量表达异柠檬酸裂解酶基因aceA、乙醛酸还原酶基因ycdW和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶基因aceK，以葡萄糖或木糖为底物实现乙醇酸的积累。但是仅通过调节以上三个关键基因的表达水平，来提高乙醇酸产率的过程中，会导致菌体生长受限及乙酸的大量积累。因此，为解决上述缺陷，提高乙醇酸产率，急需一种更为简单有效的基因工程改造策略。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种产乙醇酸的基因工程菌，所述基因工程菌过表达柠檬酸合成酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述柠檬酸合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述柠檬酸合成酶的基因含有SEQIDNO.2所示的序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pCDFDuet-1为载体，表达所述柠檬酸合成酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以真菌或细菌为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌包括E.coliBL21、E.coliMG1655、E.coliJM109、E.coliDH5α、E.coliTOP10中的至少一种。本专利技术的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法是以pCDFDuet-1为载体，与SEQIDNO.2所示的基因连接，转化至E.coliMG1655细胞中。本专利技术的第三个目的是提供一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，是在大肠杆菌中过量表达SEQIDNO.1所示的柠檬酸合成酶。本专利技术的第四个目的是提供一种乙醇酸的生产方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，28～30℃发酵20～50h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基按g/L计，含有：Na2HPO46～8，KH2PO42～4，NH4Cl0.5～1.5，NaCl0.5～1，葡萄糖8～1210，MgSO40.15～0.3，CaCl20.1～0.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵过程在基因工程菌培养至对数中期(OD600＝0.6～0.8)，加入0.8～1mMIPTG诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵过程控制发酵液pH为6.8～7.2，通气量1～1.2vvm。本专利技术还提供所述基因工程菌或所述方法在制备含乙醇酸的产品方面的应用。有益效果：本专利技术提供了柠檬酸合成酶(gltA)在提高乙醇酸产率方面的应用。本专利技术构建的表达该柠檬酸合成酶的基因工程菌Mgly145在摇瓶发酵中乙醇酸产量为1.369g/L，产率为0.504g/g-葡萄糖，较基因工程菌Mgly14的乙醇酸产率提高了30.9％。分批发酵中与Mgly14相比，Mgly145的乙醇酸产量提高了8.8％，产率提高了14.6％，而且乙酸积累量减少了67.5％。附图说明图1为重组质粒pJNU-5酶切验证图；其中，M，Marker；1,HindIII单酶切pJNU-5(5034bp)；2，HindIII和BamHI双酶切pJNU-5(3744bp和1290bp)；图2为Mgly145和Mgly14摇瓶发酵结果；图3为Mgly145和Mgly14分批发酵结果。具体实施方式表1：本专利技术中所用的菌株与质粒；实施例1：重组质粒pJNU-5的构建和重组菌株的获得以大肠杆菌MG1655(DE3)基因组为模板进行PCR扩增目的基因gltA(pJNU-5F:TTAGGATCCAAGGAGATATAATGGCTGATACAAAAGCAAA，pJNU-5R:CGCAAGCTTTTAACGCTTGATATCGCTTTTA)。BamHI和HindⅢ37℃双酶切PCR扩增的基因片段2小时，PCR产物纯化试剂盒纯化，BamHI和HindⅢ37℃双酶切质粒pCDFDuet-1两小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8-10小时，将上述连接反应液加入100μL大肠杆菌JM109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLLB液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布链霉素抗性平板(50mg/L)。37℃培养过夜，挑取单菌落进行菌落PCR验证(veri-pJNU-5F：AGCAGCCATCACCATCATCACCA，veri-pJNU-5R：CAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCT)。并将阳性菌落转接LB液体培养基，培养12-16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用BamHI和HindⅢ酶切验证。验证结果如图1。实施例2：重组质粒pJNU-4的构建EcoRI和BamHI双酶切质粒pTrc99A，获得载体片段。EcoRI和BamHI双酶切质粒pGLY-2(公开于Dhamankar,H.；Tarasova,Y.；Martin,C.H.；Prather,K.L.,EngineeringE.coliforthebiosynthesisof3-hydroxy-γ-butyrolactone(3HBL)and3,4-dihydroxybutyricacid(3,4-DHBA)asvalue-addedchemicalsfromglucoseasasolecarbonsource.MetabolicEngineering2014,25,72-81.)，获得目的基因(ycdW，aceAK)片段。T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8-10小时，将上述连接反应液加入100μL大肠杆菌JM109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLLB液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布氨苄抗性平板(100mg/L)。挑取阳性克隆进行验证，获得重组质粒pJNU-4(pTrc99A-ycdW-aceAK)。:实施例3：MG1655(DE3)中敲除乳酸脱氢酶基因ldhA采用λ-Red重组法敲除了ldhA(乳酸脱氢酶)。具体实施步骤如下。以pKD4为模板，利用引物ko-ldhAF：GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC，ko-ldhAR:ATGGGAATTAGCCATGGTCC扩增敲除框，其中包含目的基因两端同源臂各39bp、两个FRT位点及卡那抗性基因。将转化有pKD46的MG1655(DE3)菌株接于LB培养基中，30℃培养过夜，再以1％的接种量转接于50mLLB培养基，同时加100mg/L氨苄青霉素和10mM阿拉伯糖，30℃培养至OD600＝0.4～0.6，使pKD46上的三个蛋白充分表达。冰上预冷30min，5000r/min离心收集菌体，然后无菌水离心洗涤一次，10％甘油离心洗涤两次，将最终菌体浓缩于500μL感受态细胞，每管分装100μL，-80℃保藏备用。将纯化后的敲除框10μL与100μL感受态细胞充分混匀，转入0.1cm电转杯中，电击转化。电击后迅速加入1mLLB培养基，37℃孵育1h，涂布卡那抗性平板(硫酸卡那霉素浓度为35mg/L)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产乙醇酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达柠檬酸合成酶；所述柠檬酸合成酶含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种产乙醇酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达柠檬酸合成酶；所述柠檬酸合成酶含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以pCDFDuet-1为载体，表达SEQIDNO.1所示的柠檬酸合成酶。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，以真菌或细菌为宿主。4.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主；所述大肠杆菌包括E.coliBL21、E.coliMG1655、E.coliJM109、E.coliDH5α、E.coliTOP10中的至少一种。5.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将载体与含有SEQIDNO.2所示序列的基因连接，转化至宿主细胞中。6.一种提...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，马宁，张晓娟，毛银，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32