一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体、其编码基因及其表达和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体及其编码基因的序列，以及包含该编码基因的重组载体和菌株；还提供了诱导所述菌株表达家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体的方法，通过所述方法得到的MAF‑1A单体量可达2.0mg/mL；另外，还验证了通过该家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体获得的MAF‑1A单体的抗菌活性；表明以通过构建的串联表达系统有效获取具有抗菌活性的MAF‑1A单体。不仅解决了小分子多肽单体不易分离、鉴定的问题，也提高了表达效率，说明通过本发明专利技术所得到的MAF‑1A在抗真菌药中具有较大的应用潜力。

A housefly antibacterial peptide MAF-1A peptide polymer, its coding gene and its expression and Application

The present invention provides a sequence of MAF 1A peptide polymer of housefly antibacterial peptide and its encoding gene, as well as a recombinant vector and strain containing the encoding gene, and a method to induce the strain to express the MAF 1A peptide polymer of the housefly antibacterial peptide, and the MAF 1A monomer amount up to 2.0mg/mL by the method, and also verified by the method. The antibacterial activity of the MAF 1A monomer obtained through the polypeptides of the housefly antibacterial peptide MAF 1A peptide was obtained, and it was shown that the MAF 1A monomer with antibacterial activity was obtained by the construction of the series expression system. It not only solves the problem that the small molecule polypeptide monomer is not easy to separate and identify, but also improves the expression efficiency. It shows that the MAF 1A obtained through this invention has great potential for application in antifungal drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体、其编码基因及其表达和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体、其编码基因及其表达和应用。
技术介绍
近年来，真菌感染性疾病的发病率不断增高，其中白色念珠菌(Candidaalbicans)是主要病原体之一。使用抗真菌药物是控制真菌感染的主要手段，但随着耐药菌株的不断增加，抗真菌药物种类较少及抗真菌药物的毒副作用等问题的出现，寻找新药源、研发新型安全有效的抗真菌感染治疗药物已经成为医学科研工作者迫切需要解决的问题。抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)是生物体内具有抑杀细菌、真菌、病毒以及肿瘤细胞等生物活性的小分子肽类物质。由于AMPs具有抗菌谱广、低毒、不易产生耐药性等特点，因此受到广泛关注。家蝇抗菌肽MAF-1A(Muscadomesticaantifungalpeptide-1A)为家蝇抗真菌肽MAF-1C端第128位～153位功能结构域肽段，是来源于家蝇幼虫由26个氨基酸残基组成的线性小分子抗菌肽，分子量3022.5Da，其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。专利技术人前期研究发现，MAF-1A为是一阳离子多肽，N端富含赖氨酸(Lys)，其二级结构主要为α-螺旋结构，具有较好的双亲性，且具有一定耐热性，MAF-1A可通过多靶点作用方式对白念珠菌药物敏感株及耐药菌株产生较强的抑杀作用，具有新型抗真菌药物的开发潜力(WangT,XiuJ,ZhangY,etal.TranscriptionalResponsesofCandidaalbicanstoAntimicrobialPeptideMAF-1A[J].FrontMicrobiol,2017,8:894.DOI:10.3389/fmicb.2017.00894)(罗振华，吴建伟，付萍，等。人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A对白色念珠菌致病性的影响[J]。第三军医大学学报，2013，35(20)：2203～2207)。尽管MAF-1A显示了作为新型肽类抗真菌药物的开发前景，但天然MAF-1A在虫体内含量极微，而且分离纯化困难，难以满足后续研究及产业化需求。目前，获得高纯度的AMPs途径主要包括化学合成以及重组表达,采用化学合成费用昂贵，而重组表达AMPs的生产成本低，提取工艺简单，产量高，能更好的满足研究和产业化需求(KlintJK,SenffS,SaezNJ,etal.Productionofrecombinantdisulfide-richvenompeptidesforstructuralandfunctionalanalysisviaexpressionintheperiplasmofE.coli[J].PLoSOne.2013,8(5):e63865.DOI:10.1371/journal.pone.0063865)。然而，小分子多肽的克隆表达、分离、纯化、鉴定都相对复杂，在表达宿主菌体内很容易降解(祁丽，姜宁，张爱忠，等。抗菌肽研发现状及其改造策略[J]。中国畜牧兽医，2016，43(2)：450～456)，因此作为由26个氨基酸残基构成的多肽MAF-1A，由于其相对分子量较小，也不适合直接在重组表达宿主中表达。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术采用基因工程技术生产MAF-1A，并且采用串联表达方式，以增加小分子多肽的表达量和稳定性、提高目的多肽的得率、保持多肽活性。本专利技术首先提供了一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，分子量为23kD。前述肽聚体是以MAF-1A氨基酸序列(如SEQIDNO：3所示)为单体进行串联；设计该肽聚体基因时，根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化该肽聚体编码序列，在5个MAF-1A单体核苷酸序列(如SEQIDNO：4所示)间设计肠激酶(EK)酶切位点；在序列的5’和3’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点，3’端引入6×His标签，化学合成串联基因序列5×MAF-1A-6×His，即：家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体氨基酸序列SEQIDNO：1中：1～2位GlySer为BamHI酶切位点，29～33位、60～64位、91～95位和122～126位AspAspAspAspLys为肠激酶酶切位点；153～158位HisHisHisHisHisHis为6×His标签，159～160位LysLeu为HindIII酶切位点；编码家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体的基因序列SEQIDNO：2中：1～6位ggatcc为编码BamHI酶切位点的基因序列，85～99位、181～195位、277～291位和373～387位的gacgacgacgacaag为编码肠激酶酶切位点的基因序列，469～486位的caccaccaccaccaccac为编码6×His标签的基因序列，487～492位的aagctt为编码HindIII酶切位点的基因序列。本专利技术还提供了编码前述家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体(氨基酸序列如SEQIDNO：1)的基因，优选该基因的序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术提供了包含前述家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因的重组载体，优选为大肠杆菌重组载体，其制作方法是将本专利技术的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因插入到表达载体中合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为制作重组载体的一个优选的实施方案，具体的重组载体的制作方法是将前述家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因插入到克隆载体pUC19，得到重组质粒pUC19-5×MAF-1A，扩增重组质粒pUC19-5×MAF-1A，然后采用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII双酶切扩增所得的重组质粒pUC19-5×MAF-1A，并将酶切得到的5×MAF-1A基因克隆到pET-28a(+)表达载体，使该核苷酸序列位于T7启动子下游并受其调控，得到重组载体pET-28a(+)-5×MAF-1A。本专利技术还提供了包含前述家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因的重组菌株，优选重组菌株是大肠杆菌Roseeta(DE3)(E.coliRoseeta(DE3))。本专利技术还提供了一种高效表达前述家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体的方法，包括如下步骤：(1)用权利要求5或6所述的重组载体转化大肠杆菌，得到重组菌株；(2)使用步骤(1)中得到的重组菌株在摇瓶或发酵罐中进行发酵，诱导家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体的表达；(3)发酵结束后，回收并纯化所表达的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体，即得。诱导前述重组菌株表达家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体的条件优选为IPTG诱导浓度为0.2～1.0mmol/L，温度为18～36℃，时间为2～24小时；进一步的，最优条件为IPTG诱导浓度为0.8mmol/L，温度为28℃，时间为12小时。在最优条件下表达的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体经Ni-NTA纯化及酶切后，Nanodrop2000检测MAF-1A单体的浓度为2.0mg/mL，表明该系统能够较好的表达家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体。另外，再对前述经纯化的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体以抗重组蛋白兔血清为一抗、羊抗兔IgG(H+L)作为二抗进行WesternBlot鉴定，检测结果如图1所示，M为分子量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因，编码权利要求1所述的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体。3.根据权利要求2所述的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因，其特征在于，所述家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因序列如SEQIDNO：2所示。4.包含权利要求2或3所述的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体是大肠杆菌重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的制作方法如下，将权利要求2所述的肽聚体基因插入到克隆载体pUC19，得到重组质粒pUC19-5×MAF-1A，扩增重组质粒pUC19-5×MAF-1A，然后采用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII双酶切扩增所得的重组质粒pUC19-5×MAF-1A，并将酶切得到的5×MAF-1A基因克隆到pET-28a(+)表达载体，使该核苷酸序列位于T7启动子下游并受其调控，得到重组载体pET-28a(+)-5×MAF-1A。7.包含权利要求2或3所述的家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体基因的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，吴建伟，马晓琳，徐楠，张迎春，朱志翠，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52