蛋白CcilCSP2及其在筛选悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了蛋白CcilCSP2及其在筛选悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物中的应用。本发明专利技术提供了一种蛋白质，氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明专利技术从方翅网蝽若虫中克隆了化学感受蛋白CcilCSP2基因全长，并通过载体构建和原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学配基结合技术证明，该蛋白可以用来检测待测化合物是否为方翅网蝽若虫驱避性化合物，为方翅网蝽若虫的驱避性化合物筛选和设计提供了新的策略。

Protein CcilCSP2 and its application in screening of repellent compounds from the nymph of sycamore

The invention discloses a protein CcilCSP2 and its application in screening the nymph repellent compounds of the host tree. The present invention provides a protein, amino acid sequence comprising a sequence of amino acids in sequence 2. The present invention has cloned the full length of the chemoreceptor protein CcilCSP2 gene from the nymph of the square winged bug and obtained the recombinant protein encoding the gene through the vector construction and prokaryotic expression technology. Finally, it is proved by the biochemical ligand binding technique that the protein can be used to detect whether the compound is repellent to the nymph of the square winged bug. The compound provides a new strategy for screening and designing repellent compounds of nymph.

【技术实现步骤摘要】
蛋白CcilCSP2及其在筛选悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种蛋白CcilCSP2及其在筛选悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物中的应用。
技术介绍
悬铃木方翅网蝽Corythuchaciliata(Say)是近年来入侵我国的害虫，严重危害城市绿化树木悬铃木。该虫原产北美，上世纪60年代传播到欧洲，2002年首次在我国湖南省发现，目前其分布范围已扩大到湖北、上海、山东、河南和北京等地，在多地呈爆发态势。方翅网蝽的若虫在自然界中具有明显的驱避行为，以躲避危险保护种群。根据这种行为可以推测，方翅网蝽若虫对自然界中的化合物具有驱避性。然而自然界中的化合物众多复杂，如何快速地筛选出有效的驱避性化合物成为制约方翅网蝽信息素化合物开发的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。编码上述蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列1；2)其编码序列为序列表中序列1；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)任一限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。下述1)-4)中的任一种生物材料也是本专利技术保护的范围：1)含有上述核酸分子的表达盒；2)含有上述核酸分子的重组载体；3)含有上述核酸分子的重组菌；4)含有上述核酸分子的转基因细胞系。上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在筛选或检测悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在制备筛选或检测悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物产品中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述驱避性化合物为植物源驱避性化合物。本专利技术另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测化合物是否为悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：先用上述蛋白质与1-NPN结合反应，再加入待测化合物进行竞争反应，得到竞争反应产物；检测所述竞争反应产物的荧光值，计算待测化合物与上述蛋白质结合的相对荧光值，以及所述待测化合物与上述蛋白质的解离常数；若所述待测化合物满足如下条件：所述待测化合物与上述蛋白质结合的相对荧光值小于等于50％，且所述待测化合物与上述蛋白质的解离常数小于等于15.2μmol/L，则该待测化合物为或候选为悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物；若待测化合物不符合上述条件，则该待测化合物不为或候选不为悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物。上述方法中，所述驱避性化合物为植物源驱避性化合物。上述方法中，所述检测所述竞争反应产物的荧光值的波长为337nm。相同功能为能筛选或检测悬铃木方翅网蝽若虫驱避性化合物。本专利技术的实验证明，本专利技术从方翅网蝽若虫中克隆了化学感受蛋白CcilCSP2基因全长，并通过载体构建和原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学配基结合技术证明，该蛋白可以用来检测待测化合物是否为方翅网蝽若虫驱避性化合物，为方翅网蝽若虫的驱避性化合物筛选和设计提供了新的策略。附图说明图1为方翅网蝽化学感受蛋白CcilCSP2的分离纯化；图中：M：蛋白分子量标准；1：未诱导的细菌总蛋白；2：诱导后的细菌总蛋白；3：过柱后的细菌蛋白；4-8：不同浓度咪唑洗脱后的洗脱液。图2为CcilCSP2蛋白与荧光配基1-NPN的荧光结合曲线图。图3为候选配基与荧光配基1-NPN和CcilCSP2蛋白的竞争结合图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1、源于方翅网蝽的CcilCSP2蛋白的制备1、方翅网蝽若虫触角总RNA的提取利用AmbionKit试剂盒提取方翅网蝽若虫触角的总RNA，具体操作步骤如下：1)将载玻片滴入RNA缓冲液置于冰上，将活的方翅网蝽若虫放入RNAlater缓冲液中，在显微镜(NikonSMZ1500型)下解剖悬铃木方翅网蝽若虫触角，每10头解剖完后，转移到装有200μL的RNAlater的离心管中，累积到800头左右时用于总RNA提取。从-80℃取出保存的触角样品，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮快速进行研磨，此步骤在冰上操作，待研成粉末后，称取100mg组织样品装入1.5mL离心管中，然后加入1mlLysisSolution试剂，漩涡混合器上进行混合；2)将样品加至MircoFilterCattridageAssembly装置中，盖上盖子；3)4℃，12000×g，离心1min；4)弃废液，打开Assembly盖子，将上清转移至Assembly中(切勿吸取沉淀)，然后加入180μLWashSolution1，盖上盖子；5)4℃，12000×g，离心1min；6)弃废液，打开Assembly盖子，将上清转移至Assembly中(切勿吸取沉淀)，然后加入180μLWashSolution2/3，盖上盖子；7)4℃，12000×g，离心1min；8)重复step6，7；9)弃废液，在空气中干燥沉淀5～10min，再加30μLRNasefree水到装在新的1.5mL离心管的Assembly中；10)4℃，12000×g，离心1min，总RNA在该步骤溶解于离心管中；11)利用NanoDrop超微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，再将提取的总RNA保存于-80℃冰箱中，用于反转录合成第一链。2、反转录得到cDNA采用InvitrogenTM公司的高通量反转录cDNA试剂盒合成若虫触角的第一链cDNA。实验方法按照试剂盒说明书进行，具体实验步骤如下表1：表1为高通量反转录cDNA将表1所示的组分混匀，进行短暂离心，然后进行RT反应，RT反应程序：25℃10min，37℃120min，85℃5min。实验到此阶段合成了第一链cDNA，将其在-20℃条件下保存备用。3、基因克隆1)引物设计正向引物：5′CGGGATCCCGAATAAATATGCAGCTAGCGATC3′反向引物：5′GGAATTCGACATTACAATTTACAATTTATCATAATTTAAC3′。为了后续实验操作的需要，即将目的基因片段亚克隆至其他载体上，在设计引物时分别在正、反向引物中加入了BamHI，EcoRI酶切位点(用下划线表示)。引物由上海生工公司合成。2)基因克隆以方翅网蝽若虫cDNA为模板，借助ExTaq酶进行PCR扩增CcilCSP2基因。PCR反应体系如下表2(20μL)：表2PCR的反应条件为：95℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，为如下a)‑e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；e)a)‑d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列1；2)其编码序列为序列表中序列1；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)任一限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。4.下述1)-4)中的任一种生物材料：1)含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；2)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；3)含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌；4)含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李峰奇，许奕华，渠成，罗晨，王然，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11