一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用，涉及三疣梭子蟹基因工程，该三疣梭子蟹抗脂多糖因子的基因序列如SEQ NO.1所示；本发明专利技术还提供一种制备三疣梭子蟹抗脂多糖因子的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹抗脂多糖因子重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹抗脂多糖因子；与现有技术相比，本发明专利技术具有如下优点：抗脂多糖因子可能广泛参与了三疣梭子蟹抗微生物感染的先天免疫反应，重组蛋白在动物饲料添加剂和抗病原微生物新药物开发上显示出诱人的应用前景。

Anti fat polysaccharide factor of Portunus three Portunus and preparation method and application thereof

The invention relates to an anti fat polysaccharide factor of three warts and a preparation method and application, relating to the genetic engineering of the three wart crab, the gene sequence of the anti fat polysaccharide factor of the three warts, as shown by SEQ NO.1; the invention also provides a method for preparing the anti fat polysaccharide factor of the three wart crab, which is characterized by the following steps. Sudden: (1) construct the recombinant expression vector of anti fat polysaccharide factor of Portunus three; (2) the recombinant expression vector of step (1) was introduced into the host cell, and the host cell was induced and expressed, and the expression product was obtained. (3) the recombinant protein was obtained from the purification step (2), and the recombinant protein was obtained, that is, the anti fat polysaccharide factor of the shuttle three of the shuttle crab. Compared with the existing technology, the present invention has the following advantages: the anti fat polysaccharide factor may be widely involved in the innate immune response to the anti microbial infection of the three verruca verruca, and the recombinant protein shows an attractive prospect in the development of animal feed additive and the development of new antiviral drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其重组蛋白制备方法和应用。
技术介绍
三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的多种疾病在三疣梭子蟹养殖群体中频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。目前蟹病的防治仍主要采用传统抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，容易造成耐药性等问题，导致产品质量下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。因此，这就迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物进行免疫防治。抗脂多糖因子(ALF)是一种能够结合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用机制与传统抗生素不同，细菌不易产生耐药性，对正常真核细胞无毒害，日益受到广泛关注。ALF最初是从鲎中发现，它可以结合LPS，并对R型革兰氏阴性菌有明显的抑制生长作用。晶体结构分析表明，鲎ALF结构中有两个高度保守的半胱氨酸残基，它们形成二硫键所限制的β折叠区域即为LPS结合域。体外合成鲎ALF的LPS结合域，证明其确实可以与LPS结合，能够在体外调节细胞因子的分泌，有助于保护小鼠免受内毒素的攻击。随后，从对虾、螯虾、蟹等甲壳动物中也鉴定或克隆出多种抗脂多糖因子。研究表明这些甲壳动物ALF的表达水平在细菌刺激后明显上调，其重组蛋白能够抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长，提示ALF在甲壳动物固有免疫中发挥重要作用。到目前为止，关于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的报道较少。因此，识别、定性抗菌效应分子-抗脂多糖因子对研究三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子。本专利技术所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种制备三疣梭子蟹抗脂多糖因子的方法。本专利技术所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：该三疣梭子蟹抗脂多糖因子，其特征在于：所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子的基因序列如SEQNO.1所示。进一步地，所述的三疣梭子蟹抗脂多糖的氨基酸序列为MetSerArgIleSerLeuLeuLeuValLeuLeuSerIleValLeuValAlaProSerGlnAspTyrLeuLysGluGluLeuPheAsnGluValLysAspAlaLeuPheAspPheGlyAlaIleGluIleLeuAspArgValCysAsnTyrArgValMetProArgPheGluAsnTrpArgPheTyrPheLysGlyAspValTrpCysProGlyTrpThrPheIleLysGlyGluSerLeu。本专利技术为解决第二个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹抗脂多糖因子重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹抗脂多糖因子。进一步地，在所述步骤(1)中的表达载体选用pET-21a(+)。进一步地，在所述步骤(2)中，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami(DE3)。本专利技术为解决第三个技术问题提供了一种利用上述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子重组蛋白在制备抑菌药中的应用。本专利技术为解决第三个技术问题提供了一种利用上述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子在制备动物饲料抗菌添加剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术在分离出的三疣梭子蟹抗脂多糖因子的基础上，根据抗脂多糖因子基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得抗脂多糖因子蛋白，该重组蛋白具有广谱的抗菌活性，表明抗脂多糖因子可能广泛参与了三疣梭子蟹抗微生物感染的先天免疫反应，重组蛋白在动物饲料添加剂和抗病原微生物新药物开发上显示出较好的应用前景。附图说明图1为本专利技术中三疣梭子蟹基因克隆的电泳结果图；M_为DS2000DNAMarker、泳道1为三疣梭子蟹基因克隆蛋白；图2为pMD19载体双酶切前后电泳图谱；泳道1为酶切前的pMD19载体、泳道2为酶切后的pMD19载体、M_为DS2000DNAMarker；图3为甲醇诱导表达检测SDS-PAGE电泳图谱。1为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，2为未加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的诱导表达情况；3为添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的诱导表达情况；4为纯化后的电泳重组蛋白；图4为重组蛋白的含量测定的标准曲线图。具体实施方式以下通过结合附图、序列表及实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1三疣梭子蟹基因克隆以三疣梭子蟹性腺cDNA为模板，扩增编码ALF蛋白的基因片段。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经过DNA凝胶回收试剂盒纯化，与pMD19-T载体连接得到克隆质粒，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，菌液PCR验证后送测序，结果如图1和2。实施例2pET-21a(+)/Pt-ALF重组质粒在大肠杆菌Origami(DE3)中的诱导表达。确定宿主菌所表达的蛋白中含有可诱导的目的蛋白ALF后，在300mlLB培养基(含l00μg/ml氨苄)中接入5ml含有重组质粒的宿主菌Origami(DE3)，220rpm，37℃培养至OD600达到0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养5h，最后8000rpm离心5min收集菌体。结果3显示，以pET-21a(+)/Pt-ALF重组质粒在大肠杆菌中经过诱导后与诱导表达前相比具有明显的蛋白诱导表达，与计算的理论分子量相似。实施例3pET-21a(+)PtALF重组质粒大肠杆菌Origami(DE3)中重组蛋白的分离纯化。将上一步得到的菌体加入20ml缓冲液1(50mMTrispH7.9,0.5mMEDTA，50mMNaCl，5％glycerol)，混匀，冰浴条件下超声破碎(150W，工作3s停3s，10min,振幅40％)至液体线状流下，不粘稠；接着，4℃，12000rpm，离心30min，收集上清。用0.45μm滤膜过滤后，利用镍NTA琼脂糖凝胶FF进行重组蛋白的分离纯化。分离纯化的步骤包括有：①取出镍柱，用缓冲液1平衡2-5个柱床体积，控制流速为2ml/min；②将20ml细胞破碎液，0.45μm滤膜过滤后上样，流速为1ml/min；③用缓冲液1再洗2-5个柱床体积，流速为2ml/min；用含50mM咪唑的缓冲液2进行杂蛋白洗脱，缓冲液2为在缓冲液1中加入咪唑配制而成，流速为2ml/min，大约消耗5个柱床体积，然后用含400mM咪唑缓冲液2进行目标蛋白的洗脱，流速为1ml/min。实施例4重组蛋白的含量测定蛋白含量的测定采用碧云天BCA蛋白浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子，其特征在于：所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子的基因序列如SEQ NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子，其特征在于：所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子的基因序列如SEQNO.1所示。2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子，其特征在于所述的三疣梭子蟹抗脂多糖的氨基酸序列为MetSerArgIleSerLeuLeuLeuValLeuLeuSerIleValLeuValAlaProSerGlnAspTyrLeuLysGluGluLeuPheAsnGluValLysAspAlaLeuPheAspPheGlyAlaIleGluIleLeuAspArgValCysAsnTyrArgValMetProArgPheGluAsnTrpArgPheTyrPheLysGlyAspValTrpCysProGlyTrpThrPheIleLysGlyGluSerLeu。3.一种制备如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓东，母昌考，王春琳，宋微微，李荣华，刘磊，史策，叶央芳，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33