一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法，本发明专利技术的试剂盒采用磁性微粒包被的抗原、发光标记物标记的蛋白与待测样本中的抗体发生特异性反应而进行待测样品中抗体含量的测定。本发明专利技术的试剂盒实现猪繁殖与呼吸综合征抗体的定量检测，灵敏度高，检测范围宽，快速，重复性好，全自动操作及高通量检测的效果。

Antibody detection kit for porcine reproductive and respiratory syndrome and its detection method

The present invention discloses an antibody detection kit for porcine reproductive and respiratory syndrome and its detection method. The kit of the present invention adopts the specific reaction of the antigen coated with magnetic particles, the protein marked by the luminescent marker and the antibody in the sample to be measured, and carries out the determination of the anti body content in the sample. The kit can detect the antibody of porcine reproductive and respiratory syndrome, with high sensitivity, wide detection range, fast, reproducibility, automatic operation and high throughput detection.

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及猪繁殖与呼吸综合征抗体检测
，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及采用该试剂盒进行检测的检测方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，主要引起怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状。本病的传染性极强，一旦感染，发病猪将持续高温41度以上并出现急性死亡；妊娠母猪流产率高达30％以上；仔猪则100％发病并伴随着50％以上的死亡率风险，给我国的养猪业造成严重的经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，分为2个型，即欧洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)。目前我国流行主要是Ⅱ型毒株。该病毒的病毒粒子中含有一个核衣壳，核衣壳由正链RNA基因组和核衣壳蛋白(N)组成，核衣壳外边包裹一层囊膜；病毒的囊膜有6种病毒结构蛋白：E、M、GP2、GP3、GP4和GP5。M、N和GP5三种蛋白是PRRS病毒的主要结构蛋白。在我国，免疫接种是防治猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒抗原蛋白起着重要的作用，也是必须的结构蛋白，免疫后能产生保护性中和抗体。免疫后猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价与攻毒保护具有明显的相关性，所以通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证。猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白是主要的中和性抗原蛋白，其抗体是疫苗免疫后抗体水平的监测和病毒感染后抗体水平检测的主要标的，抗体水平高低与其免疫或感染状况直接相关，所以有猪繁殖与呼吸综合征抗体定量检测的现实需求。现有的检测机构有兽医站、疫苗公司、养殖场等存在着大量的样本，也对大通量的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒和仪器有着需求。现有的ELISA、病毒中和试验、胶体金等的方法难以满足。目前建立并应用的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测方法有ELISA方法、病毒中和试验、免疫荧光法、胶体金试纸条等方法，其中ELISA方法目前是猪繁殖与呼吸综合征抗体最常用的方法，ELISA所测OD值的范围在0.1-3.5，限定了所测量的抗体范围较窄，只能做到半定量，反应的时间通常在2小时左右，时间较长；病毒中和试验是通过猪繁殖与呼吸综合征病毒和抗体在细胞上中进行抗原抗体反应来判定抗体滴度，能较全面反映中和抗体的高低，全过程为病毒滴定、抗体中和、结果判定等过程需5-7天时间，全过程只能人工来操作、判定，重复性差；免疫荧光法通常也是在细胞上操作，存在灵敏度不高，重复性差等缺点；胶体金方法能快速得出结果，但是只能定性，难以定量，限制了应用范围。专利CN104237513A(公布日为2014.12.24)公开了一种甲状腺过氧化物酶抗体磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括TPO-Ab校准品，TPO-Ab稀释液，偶联有链霉亲和素的磁性微粒悬浮液，生物素标记的TPO-Ab抗原，鼠抗人酶标结合物，TPO-Ab质控品，化学发光液A和B，20倍浓缩洗液和反应管，该试剂盒对甲状腺过氧化物酶抗体的含量进行定量测定，实现灵敏度高，特异性，精密性，稳定性良好的效果。该试剂盒在人抗体上应用广泛，但在动物抗体上还未有报道。目前猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体检测主要采用的是半定量的ELISA方法并不能满足定量需求，这一点主要是由于缺乏猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体标准品和定量标准、没有准确可重复性的检测方法造成的。与兽医不同，在人医领域，各个疾病的标志物，例如上述的甲状腺过氧化物酶抗体，都已经得到充分研究，建立了通用的国家标准、国际标准或行业标准，定量简单易行，因此不同厂家生产的产品得到了规范，检测结果一致性较好。而在兽医领域，目前的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体检测市场大部分被进口的ELISA定性检测试剂占据，并且各厂家的产品检测结果相差很大，不利于畜牧养殖业发展，亟需建立定量标准以及准确可靠重复性佳的检测方法。
技术实现思路
为了解决现有兽医检测技术中存在的检测时间长、难以定量、重复性差、难以自动化等的问题，本专利技术的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，它可以定量检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的含量。为此，本专利技术还提供一种利用该试剂盒进行检测的方法，本专利技术的检测方法灵敏度高、定量检测且检测范围宽、检测时间短、重复性好。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。其中，所述的偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。其中，所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗FITC抗体-FITC偶联。其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；S2，加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白；S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中。其中，所述磁性微粒的溶液、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的比例为10mg:0.6-9.5nmol。优选的是，所述磁性微粒的溶液、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白的比例为10mg:2-8nmol。其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白间接偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：1)磁性微粒结合亲和素S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；S2，加入亲和素；S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中，构成磁性微粒-亲和素复合物；2)猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白结合生物素S1，取猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白，透析纯化；S2，依次加入生物素和封闭剂，反应；S3，透析除去未结合的生物素，获得猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素。3)磁性微粒-亲和素与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素复合物混合，通过亲和素与生物素的结合力连接磁性微粒与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白。其中，所述发光标记物标记的蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：S1，取与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白或与猪繁殖与呼吸综合征抗体特异性结合的蛋白，透析纯化；S2，加入发光标记物，反应；S3，加入封闭剂，反应；S4，透析分离未结合的发光标记物。其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白可以为猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP2a、GP3、GP4、GP5、5a、N、M、E蛋白中的一种或几种组合，并且是抗原蛋白全长、天然抗原蛋白片段、重组表达的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白全长、重组表达的抗原蛋白片段，抗原蛋白多肽、抗原蛋白化学合成物中的一种或几种的组合，所述的磁性微粒为以Fe3O4为核心，表面覆有聚合物涂层，并导入羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团的微粒。其中，所述磁性微粒的直径为0.1-5μm。优选的是，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，包括猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，包括猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白偶联磁性微粒的溶液制备方法包括如下步骤：S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；S2，加入纯化的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白；S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中。3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白间接偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：1)磁性微粒结合亲和素S1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；S2，加入亲和素；S3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；S4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中，构成磁性微粒-亲和素复合物；2)猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白结合生物素S1，取猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白，透析；S2，加入生物素，反应；S3，加入封闭剂，反应；S3，透析除去未结合的生物素，获得猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素。3)磁性微粒-亲和素与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白-生物素复合物混合，通过亲和素与生物素的结合力连接磁性微粒、猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白。4.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述发光标记物标记的蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：S1，取与猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白或猪繁殖与呼吸综合征抗体特异性结合的蛋白，透析；S2，加入发光标记物，反应；S3，加入封闭剂，反应；S4，透析分离未结合的发光标记物。5.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白选自猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP2a、GP3、GP4、GP5、5a、N、M、E蛋白中的一种或多种的组合，并且为抗原蛋白全长、天然抗原蛋白片段、重组表达的猪繁殖与呼吸综合征抗原蛋白全...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋启超，左青山，纪良心，刘聪，李炎晖，
申请(专利权)人：上海鸣捷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31