一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒，其特征在于：该技术涉及一种应用大规模平行测序平台NGS技术检测心室颤动基因鉴别诊断试剂盒。本发明专利技术的主要特征在于：A.独特设计并制备捕获探针，针对91个基因全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。

A kit for differential diagnosis of ventricular fibrillation gene

The present invention discloses a kit for differential diagnosis of ventricular fibrillation gene, which is characterized by the technique involved in the detection of ventricular fibrillation gene differential diagnosis kit by using large-scale parallel sequencing platform NGS technology. The main features of the invention are: A. unique design and preparation of capture probe, aiming at all exon fragments of 91 genes; B. design unique label sequence joint; C. universal primer for PCR amplification of probe sequence; D. design unique blend after the capture of the target fragment.

【技术实现步骤摘要】
一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种心室颤动基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台NGS技术的一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒。
技术介绍
心室颤动(ventricularfibrillation，VF)简称室颤，是指心室肌肉乱颤，心室规律有序的激动和舒缩功能消失，致使心脏失去排血功能，导致血压急剧下降至零，心室颤动是功能性的心脏停跳。心室颤动是急性心肌梗死最为严重的并发症之一，在心肌梗死急性期，心室颤动发生率为15％，约80％的心室颤动发生在梗死后6小时内，极易引发猝死，其中梗死后1小时内是心室颤动发生的最高时段。心室颤动的常见病因包括冠心病、心律失常、肥厚型心肌病、扩张型心肌病等。其中，由心律失常转化为的心室颤动主要包括：完全性或高度房室传导阻滞、长Q-T间期综合征伴尖端扭转性室性心动过速、Brugada综合征、Q-T间期正常型多形性室性心动过速和极短联律间期型多形性室性心动过速、病理性阵发性持续性室性心动过速、致心律失常性右心室发育不良性室性心动过速等；扩张型心肌病和肥厚型心肌病的室性心动过速发生率很高，其猝死病例在持续性室性心动过速组分别为56％，19％；非持续性室性心动过速组为5.4％，均发生于扩张性心肌病，猝死患者经心电图检查证实，心室颤动占66％。目前，Sanger测序作为传统的测序技术，一次反应只能对一段碱基序列进行测定，虽然精准但是效率低，单核苷酸测序成本高。而针对具有遗传异质性的复杂疾病的研究，通常需要对数个甚至数十个基因的全部编码区域进行测序以寻找有价值的突变信息，Sanger测序法不能满足测序的要求。近年，大规模DNA平行测序平台(massivelyparallelDNAsequencingplatform)已经发展为主流的基因测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一、千分之一，而且检测的稳定性和准确性已经大大提高，目前市场上的主要技术平台已经能够达到99.99％的准确性。特别是这项技术的高通量特性，使得以前花费半年或者一年以上时间进行的复杂遗传疾病的基因检测成为可能。本专利技术可以同时检测几十个甚至上百个病人的检测，非常使用于地区性的检测中心使用。目前NGS技术将广泛应用，使研究人员对疾病与遗传物质关系的研究达到了新的高度。NGS技术诊断的优势在于：1)方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血；2)任何时间都可以检查；3)不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测；4)相比反复，多项传统检查，更为经济；5)发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；6)源头确诊，一次检测，终身受益本专利技术是在现有的NGS技术之上，通过自主设计捕获全部目的基因的探针，并对探针和反应体系的不断优化，不仅可以一次性检测全部心室颤动的致病基因，更提高了检测的准确度，并极大的降低了测序的成本，使之广泛用于临床成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种心室颤动相关基因突变的目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。为实现上述目的，本专利技术采用捕获目的ABCC9、ACTC1、ACTN2、ANKRD1、BAG3、CALR3、CRYAB、CSRP3、CTF1、CTNNA3、DES、DMD、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、GATAD1、GLA、ILK、JPH2、JUP、LAMA4、LDB3、LMNA、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEBL、NEXN、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、SDHA、SGCD、SLC25A4、TAZ、TBX20、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、TTR、VCL、AKAP9、ANK2、CACNA1C、CACNB2、CALM1、CASQ2、CAV3、DPP6、GJA5、GPD1L、HCN4、KCNA5、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNH2、KCNJ2、KCNJ5、KCNQ1、NPPA、RYR2、SCN1B、SCN3B、SCN4B、SCN5A、SNTA1、TRPM4基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。本专利技术采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方法，包括以下步骤：A.设计并制备用于捕获心室颤动相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。B.将待测基因DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。C.分别加入Illumina公司DNASamplePrepKit中设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司IndexKit-PCRprimers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸(DNA)，或是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些材质。其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖以下基因ABCC9、ACTC1、ACTN2、ANKRD1、BAG3、CALR3、CRYAB、CSRP3、CTF1、CTNNA3、DES、DMD、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、GATAD1、GLA、ILK、JPH2、JUP、LAMA4、LDB3、LMNA、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEBL、NEXN、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、SDHA、SGCD、SLC25A4、TAZ、TBX20、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、TTR、VCL、AKAP9、ANK2、CACNA1C、CACNB2、CALM1、CASQ2、CAV3、DPP6、GJA5、GPD1L、HCN4、KCNA5、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNH2、KCNJ2、KCNJ5、KCNQ1、NPPA、RYR2、SCN1B、SCN3B、SCN4B、SCN5A、SNTA1、TRPM4全部编码外显子片段和两端50bp范本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒，其包括：捕获目的ABCC9、ACTC1、ACTN2、ANKRD1、BAG3、CALR3、CRYAB、CSRP3、CTF1、CTNNA3、DES、DMD、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、GATAD1、GLA、ILK、JPH2、JUP、LAMA4、LDB3、LMNA、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEBL、NEXN、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、SDHA、SGCD、SLC25A4、TAZ、TBX20、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、TTR、VCL、AKAP9、ANK2、CACNA1C、CACNB2、CALM1、CASQ2、CAV3、DPP6、GJA5、GPD1L、HCN4、KCNA5、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNH2、KCNJ2、KCNJ5、KCNQ1、NPPA、RYR2、SCN1B、SCN3B、SCN4B、SCN5A、SNTA1、TRPM4基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。...

【技术特征摘要】
1.一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒，其包括：捕获目的ABCC9、ACTC1、ACTN2、ANKRD1、BAG3、CALR3、CRYAB、CSRP3、CTF1、CTNNA3、DES、DMD、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、GATAD1、GLA、ILK、JPH2、JUP、LAMA4、LDB3、LMNA、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEBL、NEXN、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、SDHA、SGCD、SLC25A4、TAZ、TBX20、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、TTR、VCL、AKAP9、ANK2、CACNA1C、CACNB2、CALM1、CASQ2、CAV3、DPP6、GJA5、GPD1L、HCN4、KCNA5、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNH2、KCNJ2、KCNJ5、KCNQ1、NPPA、RYR2、SCN1B、SCN3B、SCN4B、SCN5A、SNTA1、TRPM4基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。2.根据权利要求1所述“一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒”，全部探针在3’采用生物素修饰。3.根据权利要求1所述“一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒”这种探针是寡聚核糖核酸(RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。4.根据权利要求1所述“一种心室颤动基因鉴别诊断试剂盒”的探针针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与ABCC9、ACTC1、ACTN2、ANKRD1、BAG3、CALR3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继征，宋雷，惠汝太，张禅那，邹玉宝，
申请(专利权)人：中国医学科学院阜外医院，
类型：发明
国别省市：北京,11