本发明专利技术涉及可溶性Jagged1肽在制备促进关节软骨修复，或在制备治疗各种软骨创伤性、退变性、老年软骨代谢失常性疾病的药物中的应用。可溶性Jagged1肽处理胎盘间充质干细胞，促进其向软骨分化后，将可溶性Jagged1肽和胎盘间充质干细胞的组合物注射至膝关节腔，抑制软骨细胞凋亡，促进软骨形成，从而修复损伤的关节软骨。本发明专利技术可用于医学和兽医学应用，可向个体单独施用，或与其它补充活性成分、试剂、药物或激素一起施用。
Application of soluble Jagged1 peptide in the preparation of drugs for articular cartilage repair
The present invention relates to the application of soluble Jagged1 peptide in the preparation of articular cartilage repair, or in the preparation of drugs for the treatment of various cartilage traumatic, degenerative, senile cartilage metabolic disorders. After treating placental mesenchymal stem cells with soluble Jagged1 peptide, the soluble Jagged1 peptide and placental mesenchymal stem cells were injected into the knee joint after differentiation to cartilage, and the apoptosis of cartilage cells was inhibited and cartilage formation was promoted and the injured articular cartilage was repaired. The invention can be used for medical and veterinary applications, and can be applied individually to individuals or with other active ingredients, reagents, drugs or hormones.
【技术实现步骤摘要】
可溶性Jagged1肽在制备促进关节软骨修复的药物中的应用
本专利技术涉及一种新的促进关节软骨修复的方法。具体涉及利用可溶性Jagged1肽处理的胎盘间充质干细胞进行关节腔注射，作为各种软骨创伤性、退变性、老年软骨代谢失常性疾病治疗方法的应用。
技术介绍
中国专利CN104162148A于2014-11-26公开了FGF9在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用，研究发现，FGF9在处于炎症环境的关节软骨细胞中可发挥阻滞关节软骨细胞异常分化的作用，在小鼠骨关节炎模型中能缓解关节软骨的降解，抑制关节软骨降解的关键酶MMP-13，减缓关节软骨的肥大化过程，可用于制备促进骨关节炎软骨修复的药物，在骨关节炎治疗领域具有潜在良好的应用前景。WO2016/112176于2016年07月14日公开了可用于在哺乳动物中增强关节软骨修复、治疗关节损伤或预防、抑制或治疗骨关节炎的药物组合物。该组合物可包括有效量的作为软骨形成祖细胞的化学引诱物的分离的蛋白质和/或有效量的作为软骨形成因子的分离的蛋白质或编码软骨形成因子的核酸序列。中国专利CN104586876A于2015-05-06公开了MicroRNA-29b作为药物靶点在关节软骨修复中的应用，本专利技术通过研究发现，microRNA-29b是调控MSCs成软骨分化后发生肥大化改变的关键miRNA，因此，本专利技术通过利用microRNA-29b抑制剂，抑制MSCs来源软骨细胞肥大化，稳定MSCs来源的软骨细胞表型，防止组织工程软骨纤维化和异位骨化，从而进一步实现组织工程软骨修复，为组织工程软骨构建、软骨支架材料设计及软骨修复提供了新思路。关节软骨损伤属于临床难治性疾病，其发生主要与组成关节软骨和韧带的细胞往往属于永久或半永久细胞，细胞自身修复能力差相关。干细胞是一种保持稳定未分化状态且在外界干预下具有多项分化潜能的细胞，在器官移植、基因改造方面有着广阔的应用前景。胎盘源性间充质干细胞具有来源丰富、质量可靠、较少涉及伦理问题的特点，因此可以作为治疗性干细胞的有效来源。Hes1蛋白通过激活软骨Notch通路促进软骨凋亡，而其抑制性配体Jagged1与PMSC的组合物则可以诱导PMSC向软骨细胞分化，促进软骨修复。
技术实现思路
根据本专利技术的实施例，希望提供一种能有效修复损伤关节软骨的方法，实现简单有效、性价比高的目的，并提供其医药用途。根据实施例，本专利技术提供的Notch信号通路抑制性配体，可溶性Jagged1肽可以促进胎盘间充质干细胞向软骨细胞分化，促进软骨形成，Jagged1的有效剂量为10ug/ml。根据实施例，本专利技术提出Jagged1和胎盘间充质干细胞关节腔注射后有效修复损伤的关节软骨。采用8ul含10ug/ml可溶性Jagged1肽和20万个胎盘间充质干细胞的缓冲液进行小鼠关节腔内注射，每周注射1次，连续注射4周。随后的实施例和试验例可以证明，本专利技术提供的Jagged1和胎盘间充质干细胞关节腔注射，具有治疗软骨创伤性、退变性疾病、老年软骨代谢失常性疾病的用途。按动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表。小鼠(20g)每次注射0.08ug可溶性Jagged1肽，人(60kg，w系数为0.11)每次注射26.4ug可溶性Jagged1肽。按10ug/ml可溶性Jagged1肽配置，根据一般人体重范围40-120kg，因此人的注射方式换算为1.96ml-5.28ml含10ug/ml可溶性Jagged1肽和20万个胎盘间充质干细胞的缓冲液进人关节腔内注射，每周注射1次，连续注射4周。其他哺乳动物的给药剂量，按照与人体的每公斤体重剂量折算。附图说明图1A、图1B、图1C、图1D为PMSCs扩增4代后，大多数PMSCs呈现类成纤维细胞样形态，流式细胞分析显示PMSCs中绝大多数细胞表达人类白细胞抗原CD29、CD73、CD90和CD166；图1E为不表达内皮标志物CD34；图1F为各细胞标志物的统计图。图2A-2D为IgG对照组和JAG1组PMSCs微团HE、AlcianBlue/OrangeG、ColII免疫组化染色及软骨形成标记物基因表达水平。图3A-3C为对照组、JAG1单纯注射组、JAG1/PMSC注射组、IgG/PMSC注射组AlcianBlue/OrangeG染色、OARSI评分和免疫组化染色。图4A-4D为对照组、JAG1/PMSC、IgG/PMSC三组TUNEL染色和统计、炎症因子表达水平。具体实施方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例应理解为仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。在阅读了本专利技术记载的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本专利技术权利要求所限定的范围。本专利技术以下实施例中，未特别标示的实验方法，即流式细胞术、RT-PCR、AlcianBlue/OrangeG染色、免疫组织化学染色、Tunel染色为本领域通用的实验方法。实施例11.1胎盘间充质干细胞(PMSC)的制备：无菌环境下胎盘绒毛及基底部分的清除，剩余部分在PBS缓冲液下充分洗涤，胰酶消化残存绒毛组织，37℃下在DMEM培养基中静置90min，之后储存在DMEM+10％FBS(小牛血清)中待用；3-5天后PMSCs开始生长，在培养皿散布80％集落后，细胞分泌色氨酸。IV期PMSCs具有特征性的CD29-APCCD73-PECD90-APC和CD166-APC表达，而CD34-APC表达较少。1.2可溶性Jagged1(JAG1)肽处理PMSCs：2.5x104PMSCs细胞经过250g离心5分钟后，形成细胞微团，细胞分为两组，在无血清成软骨分化培养基培养的基础上，分别给予10ug/mlJAG1肽或10ug/mlIgG处理，处理14天后，细胞微团用4％多聚甲醛固定后，脱水，石蜡包埋，切片后通过AlcianBlue/OrangeG和ColII(软骨组织特异性胶原)免疫组织化学染色观察。并取细胞微团抽提RNA，RT-PCR检测软骨形成标记物aggrecan、ColII和Sox9的表达。1.3实验结果：1.3.1PMSCS细胞的特点原代PMSCs经过4代增殖后，大多数PMSCs呈现类成纤维细胞样形态，流式细胞分析显示PMSCs中绝大多数细胞表达人类白细胞抗原CD29、CD73、CD90和CD166(如图1A、图1B、图1C、图1D所示)，这些细胞仍具有非常高的。而不表达内皮标志物CD34(如图1E所示)。图1F为各细胞标志物的统计图。1.3.2可溶性非结合JAG1肽对于PMSCs成软骨分化的影响。我们进一步对IgG或JAG1处理的细胞群落进行了观察。与IgG组相比，可溶性非结合JAG1诱导的PMSCs细胞形成的软骨细胞集落更多，AlcianBlue染色更深，II型胶原免疫染色说明在JAG1治疗下软骨基质生成明显(如图2A所示)。RT-PCR数据也说明软骨形成标记物aggrecan、ColII和Sox9的表达明显增加(如图2B-2D所示)。实施例2采用MLI术式建立小鼠右侧膝关节骨性关节炎(OA)模型，即12周龄小鼠右侧膝关节内侧半月板完全切除后，大量生理盐水冲洗清除组织残余，缝合关节囊，4周后成功制造创伤后关节炎模型。小鼠右侧膝关节内侧半本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.可溶性Jagged1肽在制备促进关节软骨修复，或在制备治疗各种软骨创伤性、退变性、老年软骨代谢失常性疾病的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.可溶性Jagged1肽在制备促进关节软骨修复，或在制备治疗各种软骨创伤性、退变性、老年软骨代谢失常性疾病的药物中的应用。2.可溶性Jagged1肽和胎盘间充质干细胞组成的组合物，或者可溶性Jagged1肽刺激胎盘间充质干细胞形成的组合物，在制备促进关节软骨修复，或在制备治疗各种软骨创伤性、退变性、老年软骨代谢失常性疾病的药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征是，可溶性Jagged1肽的用量为10ug/ml。4...
【专利技术属性】
技术研发人员：董玉峰，舒冰，王拥军，孙俊魁，张伟强，赵永见，张岩，王晶，赵东峰，张浩，杨骏杰，卢盛，田子睿，沙南南，
申请(专利权)人：上海中医药大学附属龙华医院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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